适度提高血钾浓度可改善心肺复苏大鼠脑组织线粒体功能

石佳欣，李诺，杨叶桂△，方卫，覃斯娜，黄京菊，陈蒙华

心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后的脑损伤是影响早期复苏成功的心脏骤停（cardiac arrest，CA）患者远期预后的重要因素。当循环功能和组织灌注恢复后，部分患者的病情进一步加重，其机制与缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）有关。亚低温能够提高机体的器官、组织，包括心、脑等对IRI的耐受性［1］。相关研究表明，高钾可提高心脏对IRI的耐受性［2］。本课题组前期研究证实，升高血钾有助于减轻CPR 后脑的IRI，但其机制尚不清楚［3］。而且，血钾过高可抑制心肌细胞兴奋性，拮抗Ca2+，抑制心脏收缩。血钾升高的幅度越高、速度越快对心脏的抑制作用则越大，严重时甚至可发生CA。因此，本研究拟探讨CPR 早期使用氯化钾的最佳剂量，并深入研究适度升高血钾对复苏后脑组织线粒体功能的影响，为探索和改善缺血性脑损伤的救治策略提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）动物准备。由广西医科大学实验动物中心提供健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体质量210～240 g，鼠龄7～8 周），动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002。本实验所有操作通过广西医科大学动物管理和应用委员会批准，符合动物伦理学标准（伦理号：202101022）。所有大鼠在SPF级环境下喂养标准饲料并自由饮水，实验室及饲养中心室内温度维持在26 ℃。（2）主要仪器。起搏电极购于成都科技市场有限公司；小型动物呼吸机（RWD407）购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；生物机能实验系统（BL-420F）购于四川成都泰盟仪器公司。主要试剂：氯化钾溶液购于河北天成药业股份有限公司；0.9%氯化钠注射液购于广西裕源药业有限公司；蛋白质浓度定量检测试剂盒购于上海杰美基因医药生物技术研究所；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）检测试剂盒及Na+/K+-ATP 酶测定试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；动物细胞/组织活性线粒体分离试剂购于上海碧云天生物技术研究所；线粒体呼吸链复合物试剂盒（GMS50007、GMS50008、GMS50009、GMS50010）购于上海杰美基因医药生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CA/CPR动物模型建立与分组

根据Chen等［4］报道的经食管电刺激诱导心室颤动（VF）建立CA/CPR 模型。术前禁食12 h，自由饮水。经腹腔注射2%戊巴比妥钠注射液（3 mL/kg）麻醉大鼠。留置股静脉导管用于药物注射，留置股动脉导管用于动脉压监测，持续监测第Ⅱ肢导心电图。将经口气管导管连接小型动物呼吸机，行机械通气（潮气量6 mL/kg，频率72 次/min）。根据随机数字表法将80只大鼠分为假手术组（SH组）、生理盐水组（NS组）及氯化钾低（LK 组）、中（MK 组）、高剂量组（HK 组），每组16只。SH组仅行麻醉及以上操作。其余各组在心电及血流动力学稳定10 min 后，将起搏电极置入食管心脏后方，停止机械通气，用12 V 交流电经食管电刺激诱导VF 1 min。CA 6 min后，立即行CPR及呼吸机机械通气，并经静脉予NS组、LK 组、MK 组、HK 组注射同体积的生理盐水和1.25%、2.5%、5%氯化钾溶液，剂量为2.4 mL/kg。CPR 后若未达到自主循环恢复（return of spontaneous circulation，ROSC），则在CPR 1 min、3 min静脉注射0.02 mg/kg肾上腺素。CPR超过10 min未达ROSC 定义为复苏失败。建模期间，室温维持26 ℃，大鼠直肠温度维持在（37.0±0.3）℃。ROSC 后持续监测动脉血压和心电1 h。ROSC 后24 h 进行相应指标的评估及检测。动物实验的流程见图1。

Fig.1 The flow chart of animal experiment图1 动物实验的流程图

1.2.2 评判标准

CA 标准：心电图呈VF、心脏停搏或无脉性电活动，血管内压力监测器上动脉搏动的突然消失或平均动脉压（MAP）＜10 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）。ROSC 标准：心电图呈窦性、房性、交界性节律，血压监测示MAP≥50 mmHg 且维持≥5 min［4］。

1.2.3 检测指标

记录各组动物基础参数，检测ROSC后1 min及10 min血钾，ROSC 后24 h 评估神经功能缺损评分（neurological deficit scores，NDS），海马组织HE 染色观察细胞形态。ROSC 后24 h，每组选取7只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，快速提取脑标本，提取右侧海马后匀浆，使用ATP 检测试剂盒测定ATP 含量和Na+/K+-ATP 酶活性；提取左侧海马后匀浆，采用差速离心法提取海马组织线粒体，运用比色法定量法测定线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，对于方差齐的数据组间多重比较行LSD-t检验；方差不齐的数据组间多重比较行Tamhane 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的基线特征比较

各组体质量、心率、MAP、电刺激时间等基础参数，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

Tab.1 Comparison of baseline characteristics between five groups表1 各组动物基线特征比较（n=16，±s）

Tab.1 Comparison of baseline characteristics between five groups表1 各组动物基线特征比较（n=16，±s）

均P＞0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F体质量/g 222.13±9.51 225.13±9.05 223.38±7.77 222.75±6.05 224.31±8.93 0.330心率/（次/min）390.88±16.20 393.81±22.98 384.94±14.22 389.56±16.86 394.25±17.94 0.711 MAP/mmHg 93.19±7.17 92.44±7.81 93.31±6.34 90.75±5.61 94.13±7.32 0.546电刺激时间/s 61.75±2.38 61.44±2.25 61.88±3.05 61.13±2.06 0.298

2.2 ROSC后各组大鼠复苏效果比较

与LK、MK 组比较，HK 组ROSC 时间延长（P＜0.05）；与NS 组相比，MK 组ROSC 后24 h NDS 升高（P＜0.05）。见表2。

Tab.2 Comparison of resuscitation effects between five groups表2 各组动物复苏效果比较（±s）

Tab.2 Comparison of resuscitation effects between five groups表2 各组动物复苏效果比较（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与SH 组比较，b与NS 组比较，c与LK 组比较，d与MK组比较，P＜0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F ROSC只数0 10 12 15 10 ROSC时间/s 92.70±14.28 83.00±10.97 82.53±12.87 98.60±15.47cd 3.927＊ROSC后24 h生存只数16 9 12 15 9 ROSC 后24 h NDS/分80.00±0.00 72.11±1.45a 73.58±1.68 76.40±1.35bc 72.67±2.23d 68.534＊＊

2.3 ROSC后MAP变化

与NS组比较，LK组复苏后2 min MAP明显升高（P＜0.05），MK 组复苏后MAP 无明显差异，HK 组ROSC 后8 min 内的MAP 下降（P＜0.05）。随着ROSC 后时间的延长，HK 组与NS 组组间MAP 差异逐渐缩小。见表3。

Tab.3 Comparison of MAP within 1 hour after ROSC between five groups表3 各组ROSC后1 h内的MAP比较（mmHg，±s）

Tab.3 Comparison of MAP within 1 hour after ROSC between five groups表3 各组ROSC后1 h内的MAP比较（mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a与SH组比较，b与NS组比较，c与LK组比较，d与MK组比较，P＜0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F n 16 9 12 15 9 2 min 87.88±3.84 72.90±2.51a 78.33±5.21b 73.60±2.97 58.90±4.46bcd 89.356＊＊4 min 86.81±3.94 74.60±3.03a 78.83±5.37 73.93±2.52 61.00±4.57bcd 68.531＊＊6 min 87.06±4.33 75.70±1.83a 79.42±5.52 74.93±2.74 62.80±4.76bcd 57.534＊＊8 min 87.25±3.73 77.00±2.10a 80.50±4.78 75.93±3.61 66.00±6.68bcd 39.473＊＊10 min 87.00±4.05 77.40±2.95a 80.58±4.62 77.13±3.87 71.30±8.54 17.440＊＊30 min 87.56±3.37 78.50±3.24a 80.75±5.03 78.27±4.53 73.80±7.70c 14.489＊＊60 min 87.81±3.80 78.40±3.60a 80.75±5.85 78.40±4.82 75.70±6.89 11.805＊＊

2.4 血钾水平变化

与NS 组比较，MK 组、HK 组ROSC 后1 min、10 min 血钾升高（P＜0.05）。与LK 组比较，MK 组ROSC 后10 min 血钾升高，HK 组ROSC 后1 min、10 min血钾升高（P＜0.05）。见表4。

Tab.4 Comparison of blood levels of K+before and after ROSC between five groups表4 各组ROSC前后血钾水平比较（n=7，mmol/L，±s）

Tab.4 Comparison of blood levels of K+before and after ROSC between five groups表4 各组ROSC前后血钾水平比较（n=7，mmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与SH 组比较，b与NS 组比较，c与LK 组比较，d与MK组比较，P＜0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F CA前3.93±0.14 3.92±0.22 3.91±0.23 3.84±0.18 3.84±0.16 0.965 ROSC后1 min 3.92±0.16 4.83±0.21a 5.22±0.28 5.82±0.35b 6.52±0.39bc 56.277＊＊ROSC后10 min 3.85±0.15 4.15±0.22 4.34±0.35 5.15±0.34bc 5.67±0.42bc 51.072＊＊

2.5 海马细胞形态及组织中相关指标比较

（1）HE染色。结果显示，SH组海马CA1区细胞排列整齐，大小正常，染色均匀，色淡，层次分明，核仁清晰。对比SH组，NS组CA1区细胞外间隙增宽，细胞肿胀，部分细胞核固缩、深染。与NS 组相比，MK 组细胞排列及形态明显改善，染色均匀，核仁比较清晰。MK 组细胞排列及形态优于LK 组及HK组。见图2。（2）ATP 含量及Na+/K+-ATP 酶活性。与SH 组比较，NS 组海马组织ATP 含量减少，Na+/K+-ATP 酶活性降低（P＜0.05）。与NS 组相比，LK 组ATP 含量升高（P＜0.05），MK 组ATP 含量及Na+/K+-ATP酶活性升高（P＜0.05）。见表5。（3）呼吸链复合体的活性。与SH 组比较，NS 组海马组织呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性降低（P＜0.05）。与NS组比较，LK组呼吸链复合体Ⅲ活性升高（P＜0.05），MK 组呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明显升高（P＜0.05），HK组呼吸链复合体Ⅲ活性升高（P＜0.05）。见表6。

Tab.5 Comparison of ATP content and Na+/K+-ATPase activity in hippocampus of rats between five groups表5 各组大鼠海马组织ATP含量及Na+/K+-ATP酶活性比较（n=7，±s）

Tab.5 Comparison of ATP content and Na+/K+-ATPase activity in hippocampus of rats between five groups表5 各组大鼠海马组织ATP含量及Na+/K+-ATP酶活性比较（n=7，±s）

＊＊P＜0.01；a与SH组比较，b与NS组比较，P＜0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F ATP/（µmol/g）336.31±12.68 290.93±11.96a 310.27±17.48b 318.10±16.21b 305.89±18.61 7.988＊＊Na+/K+-ATP酶活性/（U/mg）26.39±2.69 18.93±1.21a 20.40±2.26 22.30±2.11b 20.20±1.12 15.213＊＊

Tab.6 Comparison of the activity of respiratory chain complex in the hippocampus of rats between five groups表6 各组大鼠海马组织呼吸链复合体活性比较（n=7，µmol·min-1·g-1，±s）

Tab.6 Comparison of the activity of respiratory chain complex in the hippocampus of rats between five groups表6 各组大鼠海马组织呼吸链复合体活性比较（n=7，µmol·min-1·g-1，±s）

＊＊P＜0.01；a与SH 组比较，b与NS 组比较，c与LK 组比较，d与MK组比较，P＜0.05。

组别SH组NS组LK组MK组HK组F复合体Ⅰ5.27±0.31 4.08±0.38a 4.43±0.33 4.74±0.45b 4.34±0.53d 11.933＊＊复合体Ⅱ6.05±0.40 4.29±0.31a 4.50±0.39 5.04±0.23bc 4.42±0.32d 32.680＊＊复合体Ⅲ3.43±0.29 2.59±0.15a 2.93±0.19b 3.11±0.36b 2.90±0.13b 11.747＊＊复合体Ⅳ3.70±0.36 3.42±0.31 3.52±0.42 3.60±0.66 3.36±0.38 0.677

Fig.2 HE staining of hippocampal CA1 region of rats in each group at 24 h after ROSC(×200)图2 各组大鼠ROSC后24 h海马CA1区HE染色（×200）

3 讨论

本研究结果显示，MK组ROSC后24 h海马组织Na+/K+-ATP 酶活性和线粒体呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性升高，ATP 生成增加，NDS 升高，海马CA1 区细胞形态明显改善，而LK组、HK组NDS及海马区细胞形态未见明显改善。因此，笔者认为CPR 时适当提高血钾可改善CA/CPR 后的脑IRI，推测其机制可能是血钾可拮抗细胞K+离子外流，增加细胞内K+浓度，改善线粒体功能，但过高血钾则削弱高钾对CPR大鼠脑组织的保护作用。

3.1 适度高钾可维持细胞内外K+稳态

维持细胞内外K+浓度差是细胞发挥正常功能的重要条件，细胞内K+过量外排可介导神经元细胞凋亡。研究发现，在皮质神经元细胞诱导凋亡过程中，持续的外向电流IK和短暂的外向电流IA介导细胞内的K+排出细胞外，细胞外的高钾可通过拮抗K+外流减轻神经元的凋亡［5］。细胞膜K+跨膜转运主要由电压依赖性K+通道、配体依赖的K+通道及Na+-K+-ATP酶共同参与，Na+-K+-ATP酶主要参与细胞摄取K+的调控。当细胞缺血缺氧时，ATP 合成不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，导致细胞内K+摄取减少，细胞内渗透压下降，伴随着水分子大量涌出，细胞出现皱缩，半胱氨酸蛋白酶和核酸酶活性被激活，进而诱导细胞凋亡。缺血后快速恢复Na+-K+-ATP酶活性、增加K+摄取则可明显改善缺血后的脑损伤。当细胞内K+升高达150 mmol/L时则可拮抗细胞凋亡［6］。前期局灶性脑IRI 研究证实，使用氯化钾可抑制细胞内K+外流、增加K+摄取［7］。本研究同样发现，CPR时使用氯化钾可增加Na+/K+-ATP 酶活性。由此，笔者认为CPR 时使用氯化钾可能通过抑制细胞内K+外流、增加K+摄取，维持细胞内外K+稳态，进而减轻脑IRI。

3.2 适度高钾可改善脑组织线粒体功能

线粒体是能量合成的主要场所，ATP 的产生主要通过线粒体氧化磷酸化和线粒体呼吸链（MRC）的电子传递，MRC由位于线粒体内膜的一系列有电子传递功能的氧化还原酶组成，主要包括呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ和ATP合成酶（呼吸链复合体Ⅴ）。复合体Ⅰ和Ⅲ是呼吸链电子传递中电子泄漏和超氧化物产生的重要位点［8］。线粒体基质K+浓度和细胞内K+浓度相似，细胞内高K+是维持线粒体生理功能的基础。线粒体外K+下降会抑制呼吸链，降低呼吸速率，K+内流减少，进而导致线粒体基质体积减少，对钙诱导的通透性转化更敏感，线粒体通透性增加［9］。相反，线粒体K+内流增加，可以使线粒体基质体积增大、呼吸作用增加，进而促进线粒体能量生成，抑制活性氧（ROS）的产生；还可以抑制Ca2+内流，有效防止线粒体内钙超载。另有研究表明，线粒体K+内流增加有助于缺血时的糖酵解途径向有利于细胞存活的方向转变［10］。前期研究发现，ROSC 后24 h 氧化应激诱导的凋亡表现最明显［11］，而提高血钾可明显减少ROSC 后脑组织ROS 的生成［3］。本研究结果显示，与NS 组比较，MK 组的脑组织呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明显升高，ATP 含量增加。由此推测，适度升高血钾可能通过影响线粒体呼吸链功能提高呼吸速率，增加ATP 的合成，减少ROS 生成，减轻脑IRI。

3.3 血钾过高可削弱其对脑组织的保护作用

本研究发现，HK组的脑IRI改善不优于MK组，这可能与过高的血钾对心血管的抑制和复苏后血压下降有关。前期大脑中动脉闭塞（MCAO）模型研究显示，高剂量氯化钾（2.5%、3.2 mL/kg）比低剂量（1.25%，3.2 mL/kg）改善脑IRI 更明显［12］。本研究发现，中等剂量的氯化钾具有更好的治疗效果，分析ROSC 后MAP 的变化可以发现，相比NS 组，HK 组ROSC 后8 min 内MAP 明显降低。在正常生理状态下，维持足够的MAP 对保证脑灌注、促进脑功能的恢复或防止更严重的缺血性脑损伤至关重要。而有效循环血量、心脏射血能力和一定的血管张力是维持正常血压的基本要素。高血钾使细胞膜去极化、膜负电位下降，抑制电压依赖性慢钙通道及抑制Na+-Ca2+交换而使钙内流减少，导致心肌收缩减弱［13］。另外，细胞外K+升高，细胞K+外流减少，静息电位绝对值减小，Na+通道失活数量增加，相应的可被激活的Na+通道减少，心肌兴奋性降低，甚至停跳。与MCAO模型不同，CPR后机体的各器官，包括心脏均经历了IRI，心脏对氯化钾耐受性减低。本研究结果也显示HK 组复苏早期MAP 明显降低。因此，笔者认为CPR时适度升高血钾浓度可减轻脑IRI，但过高的血钾抑制了心脏兴奋性及收缩功能，削弱了高钾潜在的拮抗缺血性损伤的保护作用。

综上所述，CPR 早期适度升高血钾浓度可改善脑组织线粒体功能，减轻脑的IRI，但血钾浓度过高可能出现心血管系统的抑制和血压下降，削弱高血钾对脑IRI的保护作用。因此，如何平衡高血钾的获益和风险，探索高血钾拮抗脑IRI的相关机制是未来研究的重点。