1株椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉基质中的产毒情况和酸度分析

严琼英, 李乐诗, 孙钰涵, 林泽宇, 谢光宗, 邹渝丰, 罗尔伦, 陈 晶

(深圳市计量质量检测研究院,深圳 518131)

椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans),是唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)的一个病原型,能导致人类食物中毒[1]。椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒涉及食品种类较多,主要包括谷类发酵制品、变质银耳和薯类制品等[2]。研究发现椰毒假单胞菌酵米面亚种的代谢产物米酵菌酸(bongkrekicacid, BA) 是一种具有较强生物活性的毒素,是该菌引起食物中毒和死亡的主要原因,被污染的食物进入人体后可引起神经系统、消化系统及泌尿系统的损伤,临床症状表现为恶心、呕吐、腹胀、腹痛等,严重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状[3-5]。米酵菌酸食物中毒是一种病死率较高的细菌性食源性疾病,流行于印度尼西亚和我国东北、西南等部分地区[6,7]。近年来,我国发生过多起因食用含有米酵菌酸的食品导致中毒死亡的事件[8-10]。

米粉是我国南方地区的一种传统食品,尤其是广东、广西、湖南、湖北、云南、贵州、江西等省,人们习惯将米粉当做早餐主食,根据地区的不同,米粉又称米线和湿米粉,在广东一带称作湿米粉[11-13]。王海燕等[14]在广东省首起米粉引起米酵菌酸食物中毒的样品中发现湿米粉生产环节的废渣、原料及成品均未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌产毒菌株,而流通及消费环节的湿米粉(多为散装)检出了唐菖蒲伯克霍尔德菌产毒菌株,并且流行病学调查确定米粉为高危暴露食品。多年来由椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的中毒食物基本为发酵的谷类制品和长时间高温泡发的变质银耳等,但这次中毒事件中的湿米粉生产并没有发酵过程,其中椰毒假单胞菌酵米面亚种的产毒条件并不清楚,为湿米粉安全生产和管理带来困难。

酸度是衡量米粉口感的重要指标之一。食品中有机酸含量的多少,直接影响食品的风味、色泽、稳定性和品质的高低。研究发现,鲜湿米粉的酸度随储藏温度的升高而升高,但4 ℃下储存的样品酸度无明显变化[15,16]。可能是微生物利用米粉内的碳水化合物代谢产酸,米粉的酸度升高,而4 ℃的低温环境对微生物的代谢活动起到了抑制作用,酸度无明显变化[17]。BA的分子式为 C28H38O7, 是含有3 分子游离羧基的长链不饱和脂肪酸[18],目前还鲜有相关报道米酵菌酸是否会影响湿米粉酸度变化。

以市售散装湿米粉作为实验研究基质,分别接种不同初始浓度的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌液,模拟湿米粉被菌株污染,经过不同温度和时间培养后,测定湿米粉中米酵菌酸的浓度和酸度,从而了解椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉基质中的产毒条件,以及湿米粉酸度变化情况,为流通及消费环节的湿粉类食品储存条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

椰毒假单胞菌酵米面亚种(本实验室编号为83756),为实验室按GB 4789.29—2020分离的,经VITEK 2 Compact生化鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌,经产毒培养后采用GB 5009.189—2016标准方法检出米酵菌酸。

1.1.2 主要仪器与试剂

1.1.2.1 主要仪器

Ultimate3000型高效液相色谱仪,SHP-250型生化培养箱,HYC-390型冷藏箱,INE600型电热恒温培养箱,Densimat型比浊仪,BSA6202S百分之一电子天平。

1.1.2.2 主要试剂

血琼脂平板;湿米粉;米酵菌酸标准品,纯度96.9%,浓度1 mg/mL;甲醇和乙腈,HPLC 级;甲酸,HPLC 级;氨水,分析纯;色谱柱,Agilent TC C18 4.6 mm×250 mm;超纯水,18.2 MΩ·cm,实验室Milli-Q 自制;1.0 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。

1.2 方法

1.2.1 实验用菌株培养物制备

将椰毒假单胞菌酵米面亚种83756株接种于血平板37 ℃培养24 h。

1.2.2 湿米粉模拟污染实验

挑取1.2.1血平板培养物制备0.5麦氏浊度的菌悬液,经10倍系列稀释获得102、104、106CFU/mL数量级的低、中、高浓度菌液作为初始污染菌液量,分别用低浓度菌液、中浓度菌液、高浓度菌液代表102、104、106CFU/mL数量级的菌液。

称取新鲜购买的湿米粉20 g至50 mL无菌离心管中,取低浓度菌液2 mL,在湿米粉的上、中、下层各取3个点,共9个点,每个点均匀加入约222 μL菌液,充分振荡摇匀,尽量使湿米粉均匀接触菌液。同样方式,用中、高浓度菌液污染湿米粉,共获得111瓶染菌湿米粉样品,做好标记。

将经处理的108瓶湿米粉样品分别放置于不同温度(4、26、36 ℃)下培养,另3瓶未经培养处理,直接测定BA浓度和酸度。同时用加灭菌生理盐水的湿米粉作为阴性对照。

每12 h(培养12、24、36、48、60、72 h)取出不同培养温度和染菌量的湿米粉样品各1瓶,每瓶分别参照GB 5009.189—2016《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》和GB5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》中淀粉及其衍生物的食品类别进行BA浓度和酸度检测。

2 结果及分析

2.1 湿米粉的产毒情况

2.1.1 4 ℃培养染菌湿米粉的产毒情况

低、中、高3个不同初始浓度菌液污染湿米粉,放置于4 ℃培养72 h,在5个时间点分别取样检测,均未检出BA。

2.1.2 26 ℃培养染菌湿米粉的产毒情况

3个不同初始浓度菌液污染湿米粉后放置于26 ℃培养,BA的检出时间各不相同,如图1所示。污染了低浓度菌液的湿米粉,在36 h时间点被检测到BA,质量分数为3.88 μg/kg;污染了中浓度菌液的湿米粉,在24 h即可被检测到BA,质量分数为13 μg/kg;污染了高浓度菌液的湿米粉,在12 h就可被检测到BA,质量分数为0.98 μg/Kg。低浓度菌液污染湿米粉产生的米酵菌酸,72 h内浓度基本无变化,中浓度和高浓度菌液污染湿米粉产生的米酵菌酸,72 h内变化明显,呈上升趋势。污染的菌液浓度越高,变化越明显。

图1 26 ℃培养BA浓度变化

2.1.3 36 ℃培养污染湿米粉的产毒情况

3个不同初始菌液污染湿米粉后放置于恒温培养箱,72 h内36 ℃培养BA的检出情况如图2。低浓度初始菌液污染湿米粉产生BA的时间较26 ℃培养提前12 h,即24 h可检测到BA质量分数为1.15 μg/kg;中浓度初始菌液污染湿米粉的开始产毒时间仍为24 h,BA质量分数提高至378 μg/kg;高浓度初始菌液污染湿米粉的培养12 h的BA质量分数也较26 ℃提高数百倍,达490 μg/kg。36 ℃培养,3个不同浓度初始菌液污染湿米粉各时间段的BA产量均大于26 ℃培养下的产量。BA整体浓度变化趋势与26 ℃培养的基本一致。

图2 36 ℃培养BA浓度变化

2.2 不同温度点、不同初始菌液浓度处理的湿米粉酸度变化情况

不同初始浓度菌液污染的湿米粉,经过不同温度培养后,感官检查发现湿米粉无明显异味,其酸度变化见图3、图4和图5。在不同的处理方式下,低、中、高浓度污染湿米粉样品的酸度变化不大,且数值较低。酸度变化不大的原因分析：染菌培养后湿米粉中米酵菌酸质量分数最高时为6 010 μg/kg,而酸度对应的是10 g样品消耗的0.1 mol/L NaOH体积,10 g样品中米酵菌酸含量只有60 μg,换算成物质的量较小,所以样品中的米酵菌酸对酸度的结果基本没影响,3个初始菌液浓度各时间段的酸度结果与生理盐水基本一致的;可能米酵菌酸的产生抑制了湿米粉中其他腐败菌的生长,导致酸度基本没变化。

图3 低浓度菌量污染湿米粉在4、26、36 ℃温度培养的酸度变化

图4 中浓度菌量污染湿米粉在4、26、36 ℃温度培养的酸度变化

图5 高浓度菌量污染湿米粉在4、26、36 ℃温度培养的酸度变化

3 结论

湿米粉污染椰毒假单胞菌酵米面亚种的实验数据表明,接种了椰毒假单胞菌酵米面亚种菌液的湿米粉培养后,不同初始菌液浓度的湿米粉样品产生BA的浓度受到培养温度的影响最为明显。培养温度为4 ℃时,污染了3个不同初始浓度菌液的湿米粉均未检出BA。因此控制样品的存放温度为4 ℃,可有效防止BA的产生。26、36 ℃培养,中、高浓度菌液污染的湿米粉产生的BA浓度随着培养时间的延长而升高,且染菌浓度越高,湿米粉中BA被检出的时间越早,检出量越高。菌液污染浓度低(102CFU/mL),虽然在26、36 ℃培养会产生米酵菌酸但是浓度低;当菌液为中等污染浓度时(104CFU/mL),BA浓度会在24～48 h内成数倍增加,与培养时间呈正相关。样品中BA的最高质量分数达到6 010 μg/kg,这样的高含量BA可造成严重的食物中毒甚至引发人员死亡。菌液达到高污染水平时(106CFU/mL),染菌湿米粉中BA的产生规律与中浓度初始浓度菌液(104CFU/mL)污染样品一致,但产毒量更大。实验过程中,污染湿米粉的米酵菌酸质量分数最高为6 010 μg/kg,但酸度变化不大,样品感官无明显异味。初步判断由于米酵菌酸的大量产生,抑制了其他产酸为主的腐败菌生长,因此实验周期内污染湿米粉的酸度变化很小。建议湿米粉经营企业不仅要确保鲜湿粉销售过程的全程冷链,还要加强鲜湿粉的保质期管理,尤其在冷链措施不到位的情况下,产品从出厂到销售不宜超过1 d,通过标签、标识的方式提示消费者需要在采购当天全部食用。