可变剪切事件在鳖甲煎丸抑制肝癌细胞增殖过程中的作用机制及变化*

杨 利,林洪升,李 屏,韦 巍,孔茵芝,谢杨益,李明芬,3,潘爱萍△

(1.广西中医药大学第一附属医院检验诊断教研室,南宁 530022;2.广西中医药大学研究生学院,南宁 530200;3.广西中医药防治医学分子生物学重点实验室,南宁 530022)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的肿瘤类型,也是目前最常见的致死性恶性肿瘤。流行病学显示我国的HCC患者5年生存率小于15%[1]。虽然早期的HCC可以通过肝切除、移植和消融等治疗方案取得了较好的治疗效果,但HCC是一种高度侵袭性和转移性的肿瘤,早期诊断较难,导致了HCC治疗选择的局限性和低生存率[2]。鳖甲煎丸是由二十三味中药组成的中成药,源于《金匮要略·疟病脉证并治》,具有活血化瘀、软坚散结的功效[3]。越来越多的研究表明鳖甲煎丸具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节免疫功能、抑制肿瘤血管生成等作用。可变剪切是一种可增加蛋白质多样性的重要转录调控机制,国内有学者认为异常可变剪切事件可能在肿瘤发展和治疗中发挥作用[4]。本研究旨在探讨鳖甲煎丸是否通过增强可变剪切进而抑制HCC的发展,为HCC的诊断和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源

人肝癌细胞株SMMC-7721 受赠于广西中医药大学生化教研室。

1.1.2动物

60只SPF级SD雄性大鼠(许可证号:SYXK桂2013-0005),体重(200±30)g,饲养于广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室,进食配制基础饲料。

1.1.3药品

鳖甲煎丸药剂购自武汉中联公司(批号:160400),其组成包括炙鳖甲、赤硝各十二分(各90 g),蜣螂六分(45 g),芍药、牡丹、土鳖虫各五分(各37.5 g),蜂巢四分(30 g),炒乌扇、柴胡、黄芩、鼠妇虫、干姜、大黄、桂枝、厚朴、石韦、紫葳、炙阿胶各三分(各22.5 g),瞿麦、桃仁各二分(各15 g),葶苈、半夏、人参各一分(各7.5 g)。

1.1.4实验试剂和仪器

DMEM细胞培养基(批号:8169175)和细胞培养所添加的胎牛血清(批号:1828728)均购自美国Thermo Scientific公司,CCK-8试剂盒(批号:6972-75-8)购自日本同仁公司。总RNA提纯试剂盒(批号:74104)购自德国Qiagen公司。测序平台Illumina Hiseq2500购自美国Illumina公司,酶联免疫检测仪(Multiskan FC)购自美国Thermo Scientific公司,恒温培养箱(Thermo Scientific Forma)购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1血清制备

鳖甲煎丸含药血清按参考文献[5]的方法进行制备。1 g/kg的给药剂量配制鳖甲煎丸生理盐水混悬液,给予大鼠灌胃给药(10 mL/kg),每天2次,连续3 d,第4天给药2 h后腹主动脉取血,常温静置2 h后离心分离血清,56 ℃灭活30 min,经0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,置于-20 ℃下保存。将同等体积鳖甲煎丸悬液替换成生理盐水,空白血清制备方法和流程与鳖甲煎丸含药血清制备相同。

1.2.2细胞干预分组和培养

实验组采用10%鳖甲煎丸含药血清和10%胎牛血清的DMEM培养基用于培养人肝癌细胞株SMMC-7721;对照组采用10%空白血清和10%胎牛血清的DMEM培养基用于培养人肝癌细胞株SMMC-7721。培养条件均为5% CO2、37 ℃恒温条件。

1.2.3人肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性检测

CCK-8法检测鳖甲煎丸对肝癌细胞的抑制作用。在96孔板中加入约1×104个细胞悬液,每组设3个复孔,将培养板放在培养箱中预培养24 h,细胞贴壁后向培养板中加入100 μL制备血清(鳖甲煎丸含药血清或空白血清)和100 μL胎牛血清。 干预24、48、72 h后,每孔加入20 μL CCK-8液,在培养箱中继续培养2 h,酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)值,重复3次。

1.2.4细胞总RNA的提取

将约1×106个细胞悬液接种至培养瓶,培养过夜待其贴壁,将细胞培养基更换为含10%鳖甲煎丸含药血清的DMEM培养基培养24 h,RNeasy mini Kit试剂盒提取细胞总RNA。

1.2.5转录组测序和分析

细胞转录组测序和分析由深圳海一时代基因科技有限公司完成。

1.2.6差异表达基因的鉴定和分析

从两组差异表达基因中筛选出与实验组可变剪切事件相关的基因,采用ualcan对其进行肝癌患者生存分析,kmplot进行风险因素分析。

1.2.7GO富集分析和KEGG pathway富集分析

采用David数据库进行GO富集分析,网页工具metascape进行KEGG pathway富集分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组细胞增殖活性比较

实验组细胞的增殖活性较对照组明显降低,差异有统计学意义(F=66.662,P=0.003),见图1。

图1 鳖甲煎丸含药血清对肝癌细胞增殖活性的影响

2.2 两组可变剪切事件分析

两组测序后的转录组数据分别与人基因组进行比对,实验组中5 736个基因发生了可变剪切,共20 447个剪切体,对照组中 5 533 个基因发生可变剪切,共18 955个剪切体。两组均检测到7种可变剪切事件类型,对照组以外显子跳跃(SE)、第1个外显子可变剪切(AFE)为主,分别为6 348(33.49%)、 6 105(32.21%),其他5种类型占比为1.57%～9.79%。实验组主要发生的可变剪切事件类型仍为AFE、SE,分别为6 921个(33.85%)、6 775个(33.13%),其他5种类型比例为1.49%～9.27%,见图2。

ALE:最后1个外显子可变剪切;MXE:外显子互斥;RI:内含子保留;A3SS:外显子3′端的可变剪切;A5SS:外显子5′的可变剪切。

2.3 两组发生可变剪切事件基因和差异表达基因分析

两组间4 675个基因的可变剪切事件重合。实验组中有1 061个基因不重合,对照组中有858个基因不重合,96个基因差异表达明显,且存在多个抗肿瘤相关基因,分别为ARHGAP8、ATP5L2、BIRC7、CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19、TNRC18、TPT1,见图3。

图3 与实验组可变剪切事件相关的差异表达基因

2.4 差异表达基因 KEGG pathway富集分析和GO富集分析

GO富集分析显示,实验组可变剪切事件相关的差异表达基因在分子功能(MF)方面,参与了GTPase活性的正调控、信号转导、细胞形态调节;在细胞组成(CC)方面,组成细胞质、外泌体、中心黏附;生物过程(BP)方面,主要参与蛋白质结合、GTPase激活剂活性、肌动蛋白丝结合,见图4。KEGG pathway富集分析的前20个结果显示,实验组可变剪切事件相关的差异表达基因主要在肌动蛋白骨架组织、细胞黏附调节、调节型胞吐作用等方面富集,见图5。

图5 实验组可变剪切事件相关的差异表达基因KEGG pathway富集分析

2.5 差异表达基因与肝癌患者的生存分析

ualcan数据库分析显示,CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19 4个差异表达基因的表达量影响肝癌患者的生存时间(P<0.05),其余基因的高表达和低表达对肝癌患者生存时间无明显影响(P>0.05)。

2.6 差异表达基因与病毒、酒精所致肝癌患者的生存分析

在不同肝炎病毒感染所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起到保护因素的作用,见表1;酒精摄入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起到保护因素的作用,见表2。

表1 差异表达基因与肝炎病毒感染所致肝癌患者的风险因素分析

表2 差异表达基因与酒精摄入所致肝癌患者的风险因素分析

3 讨 论

目前肝癌是全世界肿瘤所致死亡的第二主要原因,而我国肝癌病例占全球病例总数的一半以上[5]。流行病学研究表明,我国80%以上肝癌因乙型/丙型肝炎病毒感染和酗酒所致[6]。HCC是最常见的原发性肝癌,80%的原发性肝癌病理诊断为HCC癌。因此研究HCC的预防和诊治迫在眉睫。

有学者认为鳖甲煎丸具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、调节人免疫功能、抑制纤维化等作用[3,7]。本研究的前期实验发现,加入10%鳖甲煎丸含药血清共同培养的SMMC-7721肝癌细胞增殖受到明显抑制,特别是培养72 h后。有研究显示,鳖甲煎丸抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖,提高肝癌细胞的凋亡率,其抑制过程涉及许多miRNA、mRNA 和信号通路,其中代谢通路及信号通路中的核心基因PNMT和ST8SIAG是其发挥作用的重要通路[7]。但肿瘤细胞的增殖、凋亡受多因素的影响,多种细胞因子和信号转导通路参与其中,组成了一个复杂多变的分子生物网络系统。

可变剪切是转录后的一种重要调控机制,可调节mRNA亚型的翻译并诱导蛋白质的多样性,从而扩展基因编码能力[8]。人类基因组中大约95%的基因经历可变剪切事件[9]。越来越多的研究表明,可变剪切与肝癌的发生、发展、治疗、预后相关,如从HCC患者中检测到的异常可变剪切基因,包括p53拮抗蛋白MDM2、E3泛素连接酶、细胞表面黏附钙黏着17蛋白等被证明是潜在的肝癌致癌基因[9-11]。也有研究表明剪切因子SRSF2在肝癌中频繁上调,与肝癌患者预后不良有关[12]。高通量测序技术的发展和肝癌样品RNA序列数据的快速积累,为研究HCC全基因组可变剪切模式提供丰富的资源,也为肝癌提供潜在的特异性诊断与治疗靶标[13]。

本研究结果显示,两组均检测到7种可变剪切事件类型,其中SE和AFE发生数量最多,且每一种可变剪切事件中,实验组发生数量均大于对照组。这些结果验证了国内学者认为可变剪切事件与肝癌的发生、发展、治疗、预后密切相关的结论[9,11]。对差异表达基因进行GO富集分析,发现这些基因参与了MF、CC等诸多过程,包括GTPase活性的正调控、信号转导、组蛋白结合等;KEGG pathway富集分析结果进一步提示,实验组可变剪切事件相关的差异表达基因与肌动蛋白骨架组织、细胞黏附调节、调节型胞吐作用密切相关。说明鳖甲煎丸在肝癌细胞发生的可变剪切事件涉及多种多样的生物学过程,其从多方面调控肝癌细胞的增殖。

在实验组调控的可变剪切事件中,鉴定出9个差异表达基因,其中CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19影响肝癌患者的生存时间。CASP9是调控线粒体凋亡通路中必不可少的关键性分子[14]。有学者研究表明CASP9在HCC中表达明显下调,其高表达预示着HCC患者预后良好[15]。HES5在HCC中具有抗肿瘤的功能。在小鼠模型中,HES5能抑制MYC依赖的肝癌发生,而促进AKT依赖的肝癌形成和干细胞特征,而细胞培养的功能分析表明,HES5可降低肝癌细胞的侵袭和增殖[16]。INPP4B在人肝癌中是一种肿瘤抑制基因。高表达INPP4B可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质细胞转换过程,此外,INPP4B可抑制肝癌细胞PI3K/AKT信号的激活[17]。SLC6A19作为谷氨酰胺转运体,在癌症的给药治疗中也发挥着重要作用[18]。综合课题组的研究结果和相关文献的报道,推测鳖甲煎丸通过可变剪切事件引起肝癌细胞CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19基因差异表达,进而在抑制肝癌的发展中发挥重要作用。在我国乙型肝炎病毒感染和酒精摄入是肝癌高发的危险因素之一。在对鳖甲煎丸调控可变剪切事件中密切相关的9个基因进行风险因素分析发现,不同肝炎病毒所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起保护作用;在酒精摄入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起保护作用。鳖甲煎丸对于我国肝癌常见的风险因素具有潜在的调节和保护作用。

综上所述,可变剪切事件可能涉及鳖甲煎丸治疗肝癌相关的基因和主要的生物学过程。因此,进一步挖掘可变剪切事件及其相关基因在肝癌中扮演的角色,对深入探讨鳖甲煎丸抑癌机制和鉴定新的肝癌靶点具有重要的意义。