敲低FAM83D调节宫颈癌细胞干细胞特性的作用及机制*

张 岚,王静依,刘述江,叶礼翠,吴欣瑜

(成都医学院第二附属医院/核工业四一六医院妇产科,成都 610057)

宫颈癌是发病率居首位的女性生殖系统恶性肿瘤,深入研究疾病的分子机制有助于发现新的治疗靶点及预后标志物,对于精准制订诊疗策略具有指导意义[1-2]。肿瘤干细胞是具有自我更新、多向分化潜能的肿瘤细胞,在恶性肿瘤发生、耐药、复发、远处转移中均发挥重要作用,是近年来研究癌症分子机制的热门靶点[3-4]。Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路是调节肿瘤干细胞特性的重要信号通路,该通路激活后增加下游Sox2、Oct4基因的表达,进而促进癌细胞维持自我更新、多向分化的肿瘤干细胞特性[5-7]。序列相似性83蛋白质家族成员D(family with sequence similarity 83,member D,FAM83D)是新发现的一种原癌基因,在子宫内膜癌、卵巢癌等多种妇科恶性肿瘤中呈高表达状态[8-9];另有相关基础研究证实,FAM83D的促癌作用与激活Wnt/β-catenin通路有关[10-11],但该基因是否在宫颈癌中调控肿瘤干细胞尚不清楚。本研究将主要通过细胞实验分析敲低FAM83D调节宫颈癌细胞干细胞特性的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织标本

选取2020年1月至2022年3月在本院手术切除的宫颈癌组织及对应癌旁组织。共纳入65对组织标本,对应患者均经术后病理诊断为宫颈癌,术前均未接受放化疗,平均年龄(59.39±9.23)岁,平均体重指数(22.83±5.52)kg/m2。

1.1.2细胞株

宫颈癌细胞株Hela、Siha、C33A及正常宫颈上皮细胞株H8均购自武汉普诺赛生命科技公司。

1.1.3主要仪器与试剂

阴性对照(NC)干扰小RNA(siRNA)、FAM83D siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司,NC短发夹RNA(shRNA)慢病毒、FAM83D shRNA慢病毒购自上海吉凯生物技术科技公司,总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技公司,兔来源FAM83D、Oct4、Sox2特异性一抗购自美国Abcam公司,β-catenin通路激动剂SKL2001购自美国MCE公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组处理

Hela、Siha、C33A、H8细胞均在含10%胎牛血清的培养基中贴壁培养,每2天更换1次培养基,待细胞铺满培养瓶底面80%后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。传代后的细胞接种在培养板内,用于FAM83D及干细胞标志基因表达的检测。

将接种在培养板内的Hela细胞分为5组:si-NC组转染NC siRNA,si-FAM83D组转染FAM83D siRNA,二甲基亚砜(DMSO)+si-NC组在含有体积分数0.1% DMSO的条件下转染NC siRNA,DMSO+si-FAM83D组在含有体积分数0.1% DMSO的条件下转染FAM83D siRNA,SKL2001+si-FAM83D组在含有20 μmol/L SKL2001(含0.1% DMSO)的条件下转染FAM83D siRNA。每组设置4个复孔,连续处理24 h,用于mRNA表达和蛋白表达的检测。

将接种在培养皿内的Hela细胞进行分组:NC-shRNA组感染NC shRNA慢病毒,FAM83D-shRNA组感染FAM83D shRNA慢病毒,感染复数为10,感染24 h后更换为完全培养基,继续培养72 h,而后将细胞用于瘤球形成实验。在瘤球形成实验过程中,同时加入体积分数0.1%的DMSO或20 μmol/L SKL2001,作为DMSO+NC-shRNA组、DMSO+FAM83D-shRNA组、SKL2001+FAM83D-shRNA组。

1.2.2荧光定量逆转录PCR检测检测基因mRNA表达水平

取宫颈癌组织和对应癌旁组织各约10 mg,以及接种在培养板内的Hela、Siha、C33A、H8细胞和分组处理的Hela细胞。采用总RNA提取试剂盒提取组织及细胞中的总RNA,采用cDNA第一链合成试剂盒对组织及细胞中的总RNA进行逆转录、合成cDNA,最后采用荧光定量检测试剂盒对FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA表达水平进行荧光定量逆转录PCR检测,PCR反应体系如下:cDNA 1 μL、荧光定量检测反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL,去离子水补足至20.0 μL。PCR反应程序:95 ℃ 3 min预变性;95 ℃ 15 s,特异性退火温度(FAM83D 60 ℃、Oct4 58 ℃、Sox2 62 ℃)25 s,延伸72 ℃ 30 s,重复40个循环,反应结束后得到循环曲线及循环阈值(cycle threshold,Ct),以β-actin为内参,按照公式2-ΔΔCt计算FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA表达水平。

1.2.3免疫组织化学检测蛋白表达水平

取石蜡包埋的宫颈癌组织及对应癌旁组织,制作病理切片后进行免疫组织化学检测。按照试剂盒说明书进行脱蜡、抗原修复,然后孵育FAM83D一抗(1∶200稀释)、Oct4一抗(1∶150稀释)、Sox2一抗(1∶200稀释),磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后孵育二抗(1∶200稀释),PBS清洗3遍后加入卵白素-生物素-辣根过氧化物酶复合物(ABC)及二氨基联苯胺(DAB)进行显色,封片后在显微镜下观察染色情况。

1.2.4Western blot检测蛋白表达水平

取分组处理的Hela细胞,加入裂解液后提取细胞蛋白,用二喹啉甲酸法(BCA)检测蛋白水平后取30 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,而后电转至硝酸纤维素膜,5%脱脂牛奶室温孵育1～2 h,用叉头框蛋白A2(FOXA2)一抗(1∶1 000)、β-catenin一抗(1∶500)或β-actin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育过夜,次日室温孵育二抗(1∶1 000)1 h。最后将硝酸纤维素膜放入凝胶成像系统,用电化学发光法显影得到FAM83D、Oct4、Sox2及β-actin条带,以β-actin条带灰度值为内参,计算FAM83D、Oct4、Sox2蛋白表达水平。

1.2.5瘤球形成实验检测肿瘤干细胞特性

取慢病毒感染的Hela细胞,用无血清培养基重悬后接种在培养板内,加入1∶50稀释的B27、20 ng/mL成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mL表皮生长因子(EGF),每2天更换1次培养基,培养10 d后观察长径>30 μm的肿瘤细胞球并计数,细胞球形成率=球形结构数/初始种植细胞数×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0软件及Prism6.0软件进行统计分析及制图,宫颈癌组织与癌旁组织比较采用配对样本t检验;细胞多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t法,两组比较采用独立样本t检验;采用Pearson相关系数进行相关性分析;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈癌组织和癌旁组织FAM83D和干细胞标志基因及其蛋白表达水平比较

宫颈癌组织中FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相对表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001),见表1。相关性分析显示:宫颈癌组织中FAM83D mRNA与Oct4、Sox2 mRNA相对表达水平均呈负相关(r=-0.351、-0.332,P<0.05)。免疫组织化学检测显示:宫颈癌组织中FAM83D、Oct4、Sox2的染色强度均较癌旁组织增强,见图1。

图1 宫颈癌组织和癌旁组织FAM83D、Oct4及Sox2的表达(免疫组织化学染色)

2.2 宫颈癌细胞株与正常宫颈上皮细胞株中FAM83D和干细胞标志基因及其蛋白表达水平比较

宫颈癌细胞株Hela、Siha、C33A中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相对表达水平均高于正常宫颈上皮细胞株H8,差异有统计学意义(P<0.05);并且,Hela细胞中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相对表达水平均高于Siha、C33A细胞,差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图2。

a:P<0.05,与H8细胞比较;b:P<0.05,与Hela细胞比较。

表2 宫颈癌细胞株与正常宫颈上皮细胞株中FAM83D、 Oct4及Sox2 mRNA相对表达水平比较

2.3 敲低FAM83D对Hela细胞干细胞特性的调控作用

si-FAM83D组Hela细胞中FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相对表达水平均低于si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。FAM83D-shRNA组Hela细胞中FAM83D mRNA及蛋白相对表达水平,以及细胞球形成率均低于NC-shRNA组,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

A:FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相对表达水平比较;B:FAM83D、Oct4及Sox2蛋白相对表达水平比较;a:P<0.05,与si-NC组比较。

A:FAM83D mRNA及蛋白相对表达水平比较;B:细胞球形成率比较;a:P<0.05,与NC-shRNA组比较。

2.4 敲低FAM83D对Hela细胞中β-catenin表达的调控作用

si-FAM83D组Hela细胞中β-catenin mRNA及蛋白相对表达水平均低于si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

A:β-catenin mRNA相对表达水平比较;B:β-catenin蛋白相对表达水平比较;a:P<0.05,与si-NC组比较。

2.5 β-catenin通路激动剂SKL2001对敲低FAM83D抑制Hela细胞干细胞特性的影响

DMSO+si-FAM83D组Hela细胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相对表达水平均明显低于DMSO+si-NC组(P<0.05);SKL2001+si-FAM83D组Hela细胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相对表达水平均明显高于DMSO+si-FAM83D组(P<0.05),见图6A、B。

A:Oct4、Sox2 mRNA相对表达水平比较;B:Oct4、Sox2蛋白相对表达水平比较;C:细胞球形成率比较;a:P<0.05,与DMSO+si-NC组或DMSO+NC-shRNA组比较;b:P<0.05,与DMSO+si-FAM83D组或DMSO+FAM83D-shRNA组比较。

DMSO+FAM83D-shRNA组Hela细胞的细胞球形成率低于DMSO+NC-shRNA组,SKL2001+FAM83D-shRNA组Hela细胞的细胞球形成率高于DMSO+FAM83D-shRNA组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图6C。

3 讨 论

肿瘤干细胞学说是近些年备受关注的恶性肿瘤发病机制之一,该学说认为恶性肿瘤组织中存在一部分具有自我更新及多向分化潜能的癌细胞亚群,同时具有癌细胞特性和干细胞特性,可能既是恶性肿瘤发生、发展的起始细胞,也是恶性肿瘤复发转移及耐药的根源[12-14]。因此,阐明肿瘤干细胞特性的调控机制有助于深入认识恶性肿瘤的分子机制,进而发现新的分子标志物及治疗靶点。

FAM83D基因是一种新发现的原癌基因,该基因编码的蛋白质定位于纺锤体,是促进细胞有丝分裂的关键蛋白。有研究报道,子宫内膜癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[15-16]、肝癌[17-18]等恶性肿瘤组织中FAM83D的高表达与肿瘤病理进展及生存预后不良有关,提示FAM83D在恶性肿瘤发生、发展中起促进作用。本研究对宫颈癌组织及对应癌旁组织的检测也证实宫颈癌中FAM83D表达水平明显升高。另有基础研究报道,FAM83D对多种癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化均具有促进作用,并且与激活Wnt/β-catenin通路[10-11]、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路[19-20]等信号通路有关。在受到FAM83D调控的信号通路中,Wnt/β-catenin通路对宫颈癌细胞肿瘤干细胞特性的维持具有促进作用。

基于上述认识,本研究就FAM83D对宫颈癌细胞干细胞特性的调控作用及机制进行了探索。(1)通过检测临床标本中干细胞标志基因表达水平证实,宫颈癌组织中Oct4、Sox2 mRNA表达水平高于癌旁组织,且与FAM83D mRNA表达水平均呈负相关,提示FAM83D可能在宫颈癌组织中参与癌细胞干细胞特性的调控。(2)设计细胞实验进行验证,在Hela、Siha、C33A 3种宫颈癌细胞中FAM83D及干细胞标志基因Oct4、Sox2的表达均高于正常宫颈上皮细胞,与宫颈癌组织中相应基因表达的变化趋势一致。Hela细胞中FAM83D、Oct4、Sox2表达增加最明显,在该细胞中转染siRNA敲低FAM83D的表达后,细胞中Oct4、Sox2表达明显降低;感染shRNA慢病毒敲低FAM83D的表达后,细胞球形成率明显降低。以上结果表明敲低FAM83D对宫颈癌细胞的干细胞特性具有抑制作用。

Wnt/β-catenin通路是目前已知参与恶性肿瘤干细胞特性调控的信号通路[21-23],也是受到FAM83D调控的信号通路。本研究在Hela细胞中证实,敲低FAM83D的表达后,β-catenin表达水平明显降低,表明FAM83D基因参与宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路的调控。在此基础上进一步分析Wnt/β-catenin通路在FAM83D调控宫颈癌细胞干细胞特性中的作用,在敲低FAM83D表达的同时联合使用β-catenin激动剂SKL2001后,敲低FAM83D降低干细胞标志基因Oct4、Sox2表达及细胞球形成率的作用明显被削弱,表明敲低FAM83D抑制宫颈癌细胞干细胞特性的作用部分与抑制Wnt/β-catenin通路有关。

综上所述,宫颈癌组织及细胞株中FAM83D表达水平增加;敲低FAM83D明显抑制宫颈癌细胞的干细胞特性,并且这一抑制作用与抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关。