无机硒添加方式及NADPH或果糖添加对酵母富硒培养的影响

陈紫荆, 孙朝阳, 张玉英, 杨思林, 魏春厅, 罗建平

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.安徽省华信生物药业股份有限公司,安徽 界首 236502)

硒(Se)是一种人体必需的微量元素,为机体维护免疫系统稳态、延缓衰老等生理功能所必需,缺硒不仅会诱发克山病、大骨节病的发生,而且增加心血管系统、内分泌系统、神经系统、生殖系统、运动系统等疾病发生的风险[1-3]。自然界中,硒分为无机硒和有机硒2种形式,由于无机硒生物利用度低且对人体毒性大,因此摄取富含硒蛋白、硒氨基酸等有机硒是人体补硒的主要途径,目前富硒酵母是最易获得、使用最为安全有效的人及动物的补硒来源[4-6]。

富硒酵母是酵母细胞在含有无机硒的培养基中经发酵培养所得。研究表明,酵母的富硒水平受限于发酵培养过程中酵母细胞将无机硒转化为有机硒的能力,不仅与无机硒的添加方式有关,而且与无机硒由酵母细胞外进入胞内及胞内无机硒转化为有机硒反应中辅助因子供应有关[7-9]。因此,在优化无机硒添加方式的同时促进无机硒有效进入胞内,提高酵母细胞转化无机硒为有机硒的能力,可以有效地促进高富硒酵母的生产。

无机硒的添加方式以添加时间和添加浓度最为关键[7-9],还原型辅酶Ⅱ(NADPH)是酵母细胞中既直接参与无机硒转化为有机硒反应的辅助因子,又是反应过程中产生的氧化产物的还原剂,果糖可促进无机硒由胞外进入胞内从而提高胞内有机硒生成反应底物浓度[10-11],鉴于此,本文以前期经诱变筛选出的酵母菌株HSX-02[12]为材料,将在无机硒添加时间和添加质量浓度优化的基础上考察NADPH或果糖的添加对酵母富硒发酵培养的影响,以期为高富硒酵母的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株为啤酒酵母(中国工业微生物菌种保藏管理中心馆藏号:1412)经NaN3诱变、H2O2筛选所得的富硒菌株HXS-02[12]。

化学试剂有:亚硒酸钠、甲酸、浓氨水、甲苯、氢氧化钠均购于国药集团化学试剂有限公司;乙二胺四乙酸、盐酸羟胺均购于阳光生物科技有限公司;3,3′-二氨基联苯胺均购于华中海威(北京)基因科技有限公司。

液体培养基由麦芽膏粉130 g/L和氯霉素0.1 g/L组成(广东环凯微生物科技有限公司),使用时加入定量蒸馏水溶解、调节pH值至5.6±0.2,并经121 ℃灭菌20 min[13]。

1.2 仪器与设备

HQ45Z恒温摇床(中国科学院(武汉)科学仪器厂);SKP-02电热恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂);DGF30/7-I电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂);V1100可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);TC-201恒温水浴锅(上海琪特分析仪器有限公司);CT15RT高速冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司);MDF-U73V SANYO超低温冰箱、MLS-3750 SANYO高压蒸汽灭菌锅(日本Osaka公司);SW-CJ-1FD超净工作台(苏州净化设备有限公司);XSZ-3G普通光学显微镜(重庆光电仪器有限公司);AL 104分析天平(梅特勒-托利多公司);PHS-3E pH台式酸度计(武汉天壹力仪器设备有限公司);LGJ-18S原位冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母生长和富硒能力的变化

按照文献[12]方法,挑取1环菌种于装液量为50 mL液体培养基的摇瓶(250 mL)中,28 ℃、180 r/min条件下振荡培养24 h作为活化的菌种。取活化的菌种以10%的接种量转移至新鲜的液体培养基中振荡培养6 h,加入亚硒酸钠至终质量浓度为25 mg/L,继续培养48 h,期间每隔6 h离心收集菌体,测定菌株生物量和富硒能力的变化。

1.3.2 无机硒添加方式对酵母富硒能力的影响

1) 无机硒的添加时间。活化的菌种在摇瓶振荡培养的0、2、4、6、8、10 h分别加入亚硒酸钠至质量浓度为25 mg/L,继续培养至24 h,测定无机硒添加时间对菌株生长和富硒能力的影响。

2) 无机硒的添加质量浓度。活化的菌种摇瓶振荡培养8 h,分别加入亚硒酸钠至质量浓度为12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 mg/L,继续培养至24 h,测定无机硒添加质量浓度对菌株生长和富硒能力的影响。

3) 无机硒添加后酵母富硒能力的变化。活化的菌种摇瓶振荡培养8 h时,加入亚硒酸钠至质量浓度为62.5 mg/L,继续培养,共培养至72 h,期间每隔8 h离心收集菌体,测定菌株生物量和富硒能力的变化。

4) NADPH对酵母富硒能力的影响。取活化的菌种,摇瓶振荡培养8 h时,加入亚硒酸钠至质量浓度为62.5 mg/L的同时分别加入NADPH至浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L,继续培养,共培养至24 h,测定NADPH对菌株生长和富硒能力的影响。

5) 果糖对富铬酵母富硒能力的影响。取活化的菌种,摇瓶振荡培养8 h,加入终质量浓度为62.5 mg/L亚硒酸钠的同时分别加入果糖至质量浓度为2、4、6、8、10 g/L,继续培养至24 h,测定果糖对菌株生长和富硒能力的影响。

1.3.3 菌体生物量与富硒能力的测定

1) 菌体生物量。培养结束后,8 000 r/min,离心10 min收集菌体,经去离子水离心洗涤2～3次后,于60 ℃下烘干至恒重,测定菌体的质量浓度。

2) 富硒能力。烘干的菌体中总硒质量分数(w总硒)及产率(用ρ总硒表示)、有机硒质量分数(w有机硒)及产率(用ρ有机硒表示)、有机硒占比的测定按文献[12]方法进行。

1.3.4 数据统计与分析

每个单独实验至少重复3次,所有实验数据均以(平均值±标准差)表示,并利用SPASS 17.0软件进行数据统计处理,采用ANOVA进行不同实验组间的邓肯氏差异分析(P<0.05),采用Origin 8.0软件绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 菌种培养时间对酵母富硒能力的影响

菌种培养时间对酵母富硒能力的影响如图1所示,图1中,不同字母表示差异显著(P<0.05),下同。由图1可知:菌株HXS-02在摇瓶培养12～24 h内快速生长,ρ菌株在24 h时达到最高,为(3.52±0.15) g/L,且显著高于其他时间点(P<0.05);菌体的w总硒随着培养时间的增加而快速增加,在24 h后逐渐减缓,但ρ总硒随时间的变化呈现先增加后降低的趋势,且在24 h达到峰值,为(7 664.9±361.17) μg/L;相应地,菌体的w有机硒、ρ有机硒在24 h前也呈现快速增长的趋势,随后趋于稳定;期间有机硒占总硒的质量分数从12 h的89%上升到24 h后的97%。由以上分析可知,24 h为菌株无机硒添加方式优化时的最佳培养时间。

2.2 硒添加时间对酵母富硒能力的影响

无机硒的添加时间不仅影响酵母的生长,而且影响有机硒的积累[14]。亚硒酸钠添加时间对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响如图2所示。由图2可知,随着亚硒酸钠添加时间的延迟,酵母培养24 h后菌株的质量浓度逐渐增加,w总硒、w有机硒在添加时间为6 h达到最高,ρ总硒、ρ有机硒在添加时间为8 h时达到最高,有机硒占总硒质量分数在添加时间为6 h时超过95%,随后稳定。酵母富硒发酵既要使收获的菌体有机硒质量浓度高,也要使收获的富硒酵母产率高,虽然亚硒酸钠在培养6 h时添加比在培养8 h时添加所收获的菌体有机硒质量浓度高,但ρ有机硒只有8 h的87%,因此选择摇瓶培养8 h为亚硒酸钠的最适添加时间。

图2 硒添加时间对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响

2.3 硒添加质量浓度对酵母富硒能力的影响

培养基中的无机硒质量浓度会影响酵母对硒的转化吸收和酵母生物量的积累,当培养基中无机硒的质量浓度过高时,酵母的生物量和有机硒转化率会受到抑制[14]。因此适宜的无机硒质量浓度是酵母富硒的重要条件。亚硒酸钠添加质量浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响如图3所示。

图3 亚硒酸钠质量浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响

由图3可知,随着ρ亚硒酸钠的增加,富硒酵母的ρ菌株逐渐下降,w总硒、w有机硒和有机硒占比逐渐上升至亚硒酸钠质量浓度为62.5 mg/L时达到最高,其中w总硒、w有机硒均比亚硒酸钠质量浓度为25.0 mg/L时的值高30%以上,而ρ总硒、ρ有机硒在亚硒酸钠质量浓度为25.0 mg/L时分别达到(8 099.7±430.9)、(7 869.7±412.7) μg/L,随后下降,至亚硒酸钠质量浓度为62.5 mg/L时重新达到峰值。考虑到菌体在亚硒酸钠质量浓度为25.0 mg/L时的w总硒,特别是w有机硒低于亚硒酸钠质量浓度为6.25 mg/L时的值,且有利于后续有机硒产率的优化提高,因此选择62.5 mg/L为亚硒酸钠的最适添加质量浓度。

2.4 发酵时间对酵母富硒能力的影响

以培养时间8 h时加入质量浓度为62.5 mg/L的亚硒酸钠作为优化的无机硒添加方式,考察酵母生长和富硒能力在培养过程中的变化,结果如图4所示。

图4 硒添加方式优化后对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响

由图4可知:ρ菌株在亚硒酸钠添加后呈先上升后降低的趋势,培养24 h达到生长峰值;w总硒、w有机硒随培养时间的延长而增加,在培养的48 h均达到峰值,随后迅速下降,有机硒占总硒的质量分数在培养24 h后均维持在97%以上,虽然ρ总硒、ρ有机硒也呈先上升后降低的趋势,但两者的峰值均出现在培养的24 h,约是培养48 h的1.3倍。综合以上结果,以ρ总硒、ρ有机硒计,酵母菌株HXS-02富硒培养时加入亚硒酸钠的适宜时间和适宜质量浓度分别为8 h和62.5 mg/L,适宜的富硒发酵时间为24 h。

2.5 NADPH或果糖的添加对富硒能力的影响

NADPH的浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响如图5所示。

图5 NADPH浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响

由图5可知,NADPH的添加可以显著影响菌株的生长,随着NADPH添加浓度的提高,菌株的生长干重呈现先增加后降低的趋势,当cNADPH在0.15～0.20 mmol/L时,w菌株最高,比未添加NADPH菌株的质量分数高23%以上;w总硒、w有机硒以及ρ总硒、ρ有机硒也随NADPH添加浓度的增加呈现先增加后减缓的趋势,并均在cNADPH为0.20 mmol/L时达到峰值,有机硒占总硒的质量分数均保持在97%以上。结果表明,在无机硒添加的同时,在培养基中加入适量的NADPH不仅有效促进菌株的生长,而且可明显提高酵母细胞转化无机硒为有机硒的能力,与未添加NADPH的培养相比,0.20 mmol/L NADPH的添加可使菌株的w总硒、ρ总硒、w有机硒、ρ有机硒分别提高15.8%、42.6%、16.1%、42.9%。

果糖的质量浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响如图6所示。

图6 果糖质量浓度对菌株HXS-02生长和富硒能力的影响

由图6可知,果糖的添加可显著促进菌株的生长,促进作用随果糖质量浓度增加至6 g/L时呈现快速上升趋势,继续增加ρ果糖则促进作用开始下降,与未添加果糖的培养相比,添加6 g/L的果糖可使ρ菌株提高32.6%;果糖添加后菌株的总硒及有机硒的质量浓度和产率表现出与菌株生长相似的变化趋势,当培养基中果糖添加至质量浓度为6 g/L时,它们的值均达到最高;与未添加果糖的培养相比,果糖的添加不改变菌株中有机硒占总硒的质量分数,添加6 g/L的果糖虽然仅使w总硒从(2 851.9±69.3) μg/g提高到(2 969.2±15.0) μg/g、w有机硒从(2 789.5±67.7) μg/g提高到(2 903.0±15.7) μg/g,但可使ρ菌株、ρ总硒、ρ有机硒分别提高32.6%、38.1%、38.0%。结果表明,果糖的添加可通过促进酵母细胞生物量的增加,从而提高富硒酵母的产率。

3 结 论

本文以前期筛选出的酿酒酵母菌株HXS-02为起始菌株,以有机硒的转化能力为指标,经酵母富硒培养过程中无机硒添加时间和添加质量浓度的优化,确定了无机硒的最佳添加方式为菌株摇瓶培养8 h时添加ρ亚硒酸钠为62.5 mg/L。在此添加方式下菌株经24 h培养后总硒和有机硒的产率最高,分别比优化前提高了14.3%、15.8%。

NADPH作为细胞代谢的一种还原力,果糖作为细胞代谢的一种能量物质,在亚硒酸钠添加的同时,适当添加NADPH或果糖可进一步提高菌株的富集有机硒能力,其中NADPH可通过促进菌株生长和转化无机硒为有机硒能力实现有机硒的高水平富集,而果糖则是通过促进菌株的生长实现有机硒的高水平富集。结果表明,酵母在富硒培养过程中采取适合的无机硒添加方式并辅以添加适量的NADPH或果糖,将可有效地提高酵母富硒培养的产率。NADPH和果糖是否对酵母富硒培养具有协同作用尚有待研究。