青钱柳提取物体内外抗氧化活性评价方法研究进展*

崔素华 梁 枫 丁伯平 秦亚东 汪荣斌 张 瑞

1 安徽中医药高等专科学校基础教学部药理教研室,安徽省芜湖市 241000; 2 皖南医学院药学系药理教研室

青钱柳又名摇钱树、青钱李,是我国南方的药食同源植物,系胡桃科青钱柳属,为国家二级保护树种。随着对青钱柳作用了解的深入,青钱柳被国家列为功能性食品原料,需求量大大增加。青钱柳的天然活性成分有多糖、三萜、黄酮和酚酸等[1]。我国自1970年对青钱柳研究以来发现青钱柳有抗氧化、降血糖、降血脂、调节免疫力、抗衰老、抑菌等作用[2-5]。

近年来,大量研究表明,合理使用抗氧化剂可以预防疾病、延缓疾病的发展进程。人工合成的抗氧化剂虽然抗氧化活性强,但对机体有潜在危害,于是如何从天然产物中提取安全有效的抗氧化物质成为抗氧化研究的主要趋势,准确评价天然植物的抗氧化活性是目前研究的热点。本文概括了目前青钱柳研究中常用的抗氧化研究方法,有利于青钱柳的进一步开发利用。目前有关抗氧化活性的检测大多采取的是体外抗氧化活性评价法、细胞模型抗氧化活性评价法与体内抗氧化活性评价法。

1 体外抗氧化活性评价方法

体外抗氧化评价方法实验操作简单快速并且不需要动物实验,因此一般首选体外评价法对物质的抗氧化活性进行初筛。目前常用于对青钱柳进行抗氧化活性检测的机制主要有以下几种:(1)检测样品清除自由基的能力;(2)检测样品的还原能力;(3)检测样品对脂类物质的氧化抑制能力。

1.1 清除自由基型评价方法 自由基由于含有未配对电子,所以极不稳定,其氧化反应能力很强,能使机体内的大分子物质过氧化,从而导致不可逆性损伤,自由基过量是许多疾病产生的诱因。清除自由基是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制,因此评价青钱柳的自由基清除能力可以作为评价其抗氧化活性的重要指标。

1.1.1 清除DPPH自由基评价方法:DPPH(二苯代苦味酰基自由基)清除方法由Bios[6]于1958年首先提出, 其自由基非常稳定,在乙醇等溶液中显紫色,在517nm处吸光值很强,DPPH清除方法因为操作简单快捷,被广泛应用于青钱柳提取物的抗氧化能力测定。

邹荣灿等[7]以甲醇定容DPPH溶液,对不同产地青钱柳多糖进行DPPH清除能力研究发现,在0.01～2.0mg/ml浓度范围内,青钱柳多糖对DPPH的清除能力随多糖浓度的上升而增大,呈一定量效关系,各产地青钱柳多糖对DPPH清除能力的差异不明显,青钱柳的抗氧化能力与其多糖浓度呈剂量关系。岳喜良等[8]以甲醇定容DPPH溶液,对青钱柳样品进行DPPH清除能力研究发现,施氮量显著影响了青钱柳叶中DPPH的IC50(DPPH为50%时的样品浓度),DPPH的IC50与黄酮类化合物呈显著负相关,低氮处理的青钱柳叶抗氧化能力明显高于其他实验组。

DPPH方法简单快捷且重现性好,是评价青钱柳抗氧化活性应用频率最高的分析方法之一,但是缺点是清除反应仅在甲醇、乙醇等有机溶剂中发生, 不能在水溶液中应用,针对这个缺点部分学者对此进行了改进,使其能在水溶液中进行测定。黄四新等[9]通过改进的方法用水将青钱柳化合物稀释后配制成不同浓度的DPPH溶液进行测定,发现化合物浓度与DPPH清除能力呈明显量效关系,且都能较快达到最大清除能力,部分化合物对DPPH的清除能力强于维生素C。

1.1.2 清除ABTS自由基评价方法:ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]自由基清除方法由Marklund[10]于1979年首先提出。ABTS是一种化学显色剂,在734nm或414nm处测定反应溶液吸光度即可测定样品的抗氧化能力。

TEAC[2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]自由基方法是Miller[11]于1993年开发的基于ABTS清除自由基的方法,其所用的自由基溶液是预先反应好的溶液,与传统的ABTS方法相比可以降低植物提取物等抗氧化物质中其他化合物的影响。

郑晓杰等[12]对青钱柳提取物进行ABTS清除能力测定,发现青钱柳提取物可有效清除ABTS自由基,且存在采收期和产地变异性。郭彤彤等[13]对青钱柳黄酮进行TEAC法检测发现,样品的ABTS自由基清除活性呈浓度依赖性变化,证实青钱柳黄酮在食用大豆油中的应用能减缓大豆油的氧化,延长储存期限,并且可以预防人体疾病,避免合成抗氧化剂引起的食品安全问题。

ABTS法因为快速简便被普遍用于常规抗氧化剂清除自由基能力的评价,水溶性化合物和脂溶性化合物都可以测定。不过ABTS法本质上是用TEAC值来表征被测物质清除ABTS+·这种自由基的能力, 并不是直接反映被测物质的活力,所以想全面的评估一种物质的抗氧化能力需要结合其他方法进行全方位的测定。

1.1.3 清除超氧阴离子自由基评价方法:超氧阴离子自由基(O2·-)是自由基引起机体中毒的主要原因,其作为链式反应的引发剂可以通过反应生成其他自由基,导致多糖解聚、核酸链断裂以及不饱和脂肪酸过氧化,引起膜损伤、线粒体氧化磷酸化而导致机体疾病。因此,检测青钱柳对O2·-的清除能力可以用来评价其抗氧化活性。超氧阴离子O2·-评价方法是通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)还原吩嗪硫酸甲酯-(PMS)生成O2·-,然后和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)反应生成在560nm有强吸收峰的蓝色产物,当抗氧化物质加入PMS-NADH-NBT体系后,通过吸光度测定可以计算出抗氧化物质的清除自由基能力。

胡世一等[14]以维生素C作阳性对照,在536nm处检测青钱柳内生真菌发酵产物清除O2-·的能力,发现18株菌株清除O2-·能力普遍较弱,清除率均<50%。黄新月等[15]对青钱柳多糖的超氧自由基清除能力进行检测,发现其清除率随浓度的增加而增加,呈剂量依赖关系。同时多糖的羧甲基化取代度升高后清除率降低,考虑可能与羧甲基化修饰以后青钱柳多糖溶解性降低有关。

1.1.4 清除羟基自由基评价方法:羟基自由基(OH·)是毒性最大的自由基,氧化能力很强,带有一个不成对电子,可以引起电子转移、夺取氧原子和羟基化等反应,与活细胞中的分子发生反应导致组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质解聚与聚合、多糖解聚而造成损害。羟自由基清除法也是评价青钱柳体外抗氧化活性比较常用的方法。

刘贤贤等[16]对65%甲醇的青钱柳叶浸膏进行羟自由基清除能力测定,发现在相同实验条件下,IC50越小,对羟自由基的清除能力越大,抗氧化效果越好。夏和元等[17]以不同时间采集的青钱柳叶为研究对象,检测其对OH·的清除能力,发现样品对羟基自由基有较好的清除能力但存在明显差异,其中7月份绿色叶阴干和杀青样品效果最好。

1.2 还原金属离子评价方法 物质的还原能力与其抗氧化活性之间有着明显的相关性,目前最常用的是还原金属离子评价方法是还原铁离子法(FRAP)。FRAP最早由Benzie等[18]提出,主要用于血浆中抗氧化成分的评价,后来广泛用于植物抗氧化活性检测。该方法的原理是在较低pH环境下,Fe3+-三吡啶三吖嗪可被样品还原为二价铁形式,呈现出蓝色,吸光度593nm时光吸收值最高,根据其吸光度值的大小评价抗氧化能力,吸光度值与抗氧化能力成正比。

陈培等[19]对不同基因型青钱柳进行四种不同的光质处理后测定其FRAP,发现蓝光和绿光更有利于提高青钱柳叶中抗氧化活性,蓝光处理和金钟山基因型的青钱柳叶抗氧化能力方面表现更佳。实验结果表明在青钱柳培育过程中,可通过改变光照、选择基因型来提高青钱柳叶的抗氧化活性。陈玮玲等[20]对不同青钱柳叶提取物进行FRAP测定,发现样品还原能力与DPPH自由基清除能力相似,四种不同溶剂提取物中70%乙醇提取物还原能力最强,总酚、总黄酮含量与还原能力呈正相关。

FRAP方法操作简单快捷、重现性好,但也有学者认为其生物相关性较差,不能作为抗氧化能力检测的最佳选择。

1.3 抑制脂质过氧化评价方法 脂质中不饱和脂肪酸通过自动氧化生成不稳定状态的氢过氧化物,然后继续分解生成短碳链的小分子化合物如醛、酮等。硫代巴比妥酸法常用于检测青钱柳的脂质过氧化,其原理是体内高不饱和的脂肪酸经过氧化生成过氧化脂质(LPO),最后生成丙二醛(MDA)。

吴菲菲等[21]对不同浓度的青钱柳多糖溶液进行脂质过氧化(LPO)抑制能力检测,发现青钱柳多糖对卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用与浓度呈正相关。当浓度为1.6mg/ml时,青钱柳粗多糖和精制多糖对卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用最强,在0.05～1.6mg/ml范围内,青钱柳粗多糖对LPO的抑制效果优于其精制多糖。段小群等[22]对青钱柳多糖进行抗脂质过氧化研究发现,青钱柳多糖可减轻小鼠肝组织自发性及自由基诱导剂引起的肝脂质过氧化水平,阐明青钱柳多糖有明显的抗脂质过氧化作用,并具有一定的量效关系。

脂质体系抗氧化检测的缺点主要是实验耗时长且操作相对复杂, 实验结果也容易受到多种因素影响。

2 体内抗氧化活性评价方法

体外抗氧化活性评价方法的优点是操作简单迅速、重现性好,但体外评价体系与生物体内实际环境相差较大,某些在体外评价法里表现出高抗氧化活性的物质在生物体内可能活性较差,所以需要在体外评价后再进行体内评价从而进一步证实抗氧化剂的活性。青钱柳体内抗氧化活性评价可以通过在相应实验周期内检测动物体内某些酶活性或代谢产物含量来进行抗氧化能力判断,SOD、MDA、GSH-Px等常被用作重要的抗氧化指标, 它们的协同作用可以维持机体自由基的动态平衡, 同时阻止脂质过氧化和此过程中产生的中间产物对机体造成损害。

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)法 SOD是一种抗氧化金属酶,可以催化超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢和氧,可以保持生物体自由基产生和过氧化物清除能力均衡,从而起到保护细胞的作用。

2.2 丙二醛(MDA)法 MDA是在脂质过氧化反应链终止阶段产生,可以引起细胞肿胀坏死、细胞膜结构破坏。通过对MDA进行含量测定,可以分析机体细胞受到自由基攻击时组织的损伤程度。

2.3 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)法 GSH-PX是一种过氧化物分解酶,催化还原型谷胱甘肽变为氧化型谷胱甘肽,可以使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,同时还可以促进H2O2的分解,减少氧自由基损伤细胞。

赵静等[23]研究发现青钱柳能明显增高肝脏SOD和GSH-Px的活性,降低肝脏MDA的含量,通过清除机体内脂质过氧化产物,间接发挥抗氧化作用。卢振华[24]研究发现青钱柳可以显著增高SOD的活性, 降低机体内MDA含量,保护机体免受自由基伤害。陈丹等[25]研究发现富硒青钱柳—黄精复方可有效提高2型糖尿病大鼠血清中SOD、GSH-Px的活性,降低血清中MDA的含量,降低氧化应激程度,改善糖尿病动物机体抗氧化能力。

3 细胞模型抗氧化活性评价方法

动物实验结果准确,可以真实反映青钱柳在体内的抗氧化程度,但费用较高、实验周期也较长,所以也可以通过细胞模型抗氧化活性评价方法进行评价。

贺海波等[26]在对青钱柳不同溶剂提取物进行研究时发现,其对模型大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)细胞的保护作用与其增强内源性抗氧化系统功能密切相关。罗丹等[27]发现富硒青钱柳—蛹虫草复方能降低NIT-1细胞内ROS水平,发挥抗氧化作用。王胤康等[28]研究了青钱柳多糖和黄酮对胰岛素抵抗的人源肝癌细胞的影响,发现它们能够逆转胰岛素抵抗,增加肝癌细胞葡萄糖摄取量,降低α-葡萄糖苷酶活性。

4 展望

青钱柳是一种具有多种功能的生物抗氧化剂,综合对其进行抗氧化成分研究的过程发现,每种抗氧化活性评价方法都有一定的局限性和缺点,如果仅通过一种方法来进行评价是不合理。因此,应该建立一套多方案评价体系来评价青钱柳的抗氧化能力,使实验结果更有科学利用价值,更好地为青钱柳的开放利用提供参考依据。