降低崇仁麻鸡汤嘌呤用树脂的筛选及工艺研究

赵少添,陈树泓,吴凌伟,王水兴*

(1.南昌大学 化学化工学院,南昌 330031;2.南昌大学中德联合研究院,南昌 330047)

鸡肉美味营养,富含人体所需的各种氨基酸,是优质的动物蛋白质来源[1-2]。鸡汤在熬制过程中,鸡肉中的部分水溶性成分会溶解于鸡汤中,随着炖煮时间的增加,鸡汤中的营养含量也随之增加[3]。鸡汤的营养含量虽不如鸡肉高,但经过长时间炖煮的汤中营养物质经过初步水解,更容易被人体消化吸收。

痛风是人体内嘌呤代谢障碍引发的疾病[4]。在痛风患者中,因遗传因素而痛风的患者仅占总患者的10%～20%,多数患者是不正确饮食或其他疾病而引发痛风,其中摄入嘌呤含量过多是重要原因之一。由于鸡汤中嘌呤含量较高,痛风患者在痛风急性阶段应避免食用鸡汤[5-6]。研究表明,低嘌呤饮食对高尿酸血症及痛风患者的症状有明显的改善作用[7-8]。因此,饮食治疗是痛风患者的重要治疗方式之一。

当前对低嘌呤食品的研究较少,目前方法有吸附法[9-10]、盐析吸附法[11-12]、酶法[13-14]、超声波法[15]、微生物法[16-17]。树脂吸附分离由于吸附量大、操作简便、选择性好、可反复使用和成本低等特点[18-19],被广泛应用于多数天然产物的分离提取中[20-21],且目前鲜有应用树脂脱除食品中嘌呤物质的研究。为此,本研究以崇仁麻鸡汤为原料筛选合适型号的树脂并探究吸附工艺参数。降低鸡汤嘌呤含量既符合消费者的保健要求,又提高了产品的附加值,同时为后期工业化生产提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

崇仁麻鸡:江西崇仁县麻鸡发展有限公司;树脂:江苏苏青水处理工程集团有限公司;10%四丁基氢氧化铵溶液(色谱纯):上海麦克林生化科技股份有限公司;腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、甲酸、三氟乙酸(均为分析纯):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;RV05旋转蒸发仪 上海万捷科技有限公司;JSM-6701F冷场发射扫描电镜能谱仪 日本JEOL公司;Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;HWY-200全温摇床 常州诺基仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鸡汤样品制备

将新鲜崇仁麻鸡宰杀,除去血、毛、内脏后,用自来水冲洗干净置于砂锅中炖煮(肉和水的质量比为 1∶3),先用大火煮沸,待煮开后用小火炖煮120 min, 冷却后去除上层黏稠鸡油,用滤网过滤大部分杂质后将鸡汤分批保存使用。

1.3.2 样品嘌呤测定前处理

取 5 mL鸡汤,置于 50 mL 离心管中,加入 10 mL 甲酸和三氟乙酸(体积比为1∶1),立即置于沸水浴中,100 ℃下水解45 min,水解结束后迅速冰浴冷却;用 10 mol/L KOH溶液调至中性,以5 000 r/min离心10 min,取上清液用稀磷酸将滤液的 pH 调至 3.8以下,以5 000 r/min离心15 min,取上清液定容,经过 0.22 μm 微膜过滤后,在 256 nm 波长处根据标准曲线求出鸡汤中嘌呤水解后的嘌呤含量[22]。

1.3.3 嘌呤含量测定

采用高效液相色谱法测定样品中嘌呤含量。色谱柱规格为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)。结合李婷婷等[23]、曲欣等[24]的方法,将高效液相色谱条件设定为柱温32 ℃、检测波长254 nm;流速1.0 mL/min;进样体积10 μL;流动相水∶甲醇∶冰乙酸∶10% 四丁基氢氧化铵970∶20∶5∶5。取等体积的4种嘌呤标准储备液,配制混合标准储备液。以超纯水稀释成质量浓度分别为5,10,20,30,40,50 mg/L,用 0.22 μm 滤膜过滤至进样瓶中,在上述液相条件下上机检测,以峰面积(Y)及样品质量浓度(X)作线性回归,制作标准曲线。得到标准曲线方程:腺嘌呤y=50.76x+33.728(R2=0.998 2);鸟嘌呤y=36.109x+0.783 3(R2=0.999 9);次黄嘌呤y=39.657x+6.569 6(R2=0.999 7);黄嘌呤y=26.323x+20.926(R2=0.998 0)。计算4种嘌呤含量之和得到总嘌呤含量。

1.3.4 树脂型号筛选

将10种树脂按照所处类型分别进行预处理,用滤纸吸干预处理后的树脂表面的水分,分别称取3.0 g,置于200 mL的锥形瓶中,各加入50 mL鸡汤,置于全温摇床中,在30 ℃的恒温条件下振荡6 h,每组重复3次,测定不同树脂嘌呤吸附率。

1.3.5 树脂形态结构的表征

1.3.5.1 SEM

取吸附前后001×8树脂置于附有碳导电胶的载物台上,在真空喷镀仪上镀一层金属薄膜以便导电,在扫描电镜上进行观察,条件为电压5 kV、工作距离 12.3～12.7 mm[25]。

1.3.5.2 FT-IR

将吸附前后001×8树脂研磨粉碎后与KBr混合,压制成薄片,扫描范围为4 000～400 cm-1,仪器分辨率为4 cm-1,扫描次数为64次。

1.3.6 单因素实验

1.3.6.1 树脂用量

在锥形瓶中分别投加0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 g的001×8离子交换树脂,移取50 mL鸡汤于锥形瓶中,在30 ℃、160 r/min条件下振荡吸附6 h,取吸附后的溶液测定树脂嘌呤吸附量与吸附率。

1.3.6.2 吸附温度

在树脂最优用量条件下,保持其他条件与前面一致,将其分别置于15,20,25,30,35,40 ℃全温摇床上,测定嘌呤吸附率。

1.3.6.3 吸附时间

在树脂最优用量及吸附温度条件下,保持其他条件与前面一致,分别振荡0.5,1,2,3,4,5,6 h后测定嘌呤吸附率。

1.3.6.4 振荡速度

在前面探究的基础上,分别调节摇床振荡速度为80,100,120,140,160,180 r/min,测定嘌呤吸附率。

1.3.7 响应面优化实验设计

在单因素实验的基础上,设计四因素三水平响应面实验,对鸡汤总嘌呤的去除率进行响应面实验,响应面实验因素及水平见表1。

表1 响应面实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment design

1.3.8 树脂的再生及循环实验

探讨树脂的再生效果和循环利用效果。在响应面探究的最优条件下进行吸附实验,将吸附后的树脂用50 mL 2% HCl 溶液脱附5 h,将脱附后的树脂再进行嘌呤吸附实验,重复 10次,测定每次实验树脂对鸡汤嘌呤的去除率。

2 结果与分析

2.1 不同树脂的吸附效果分析

分别采用10种树脂静态吸附鸡汤,探究不同树脂对鸡汤嘌呤物质的吸附率,结果见图1。

图1 不同型号树脂对嘌呤的吸附率Fig.1 The adsorption rates of different types of resins on purines

实验测试了目前应用较广泛的10种型号树脂,其中包括5种阳离子交换树脂、3种阴离子交换树脂以及2种大孔吸附树脂。由图1可知,001×7树脂和001×8树脂是吸附效果最好的两种树脂,吸附率均超过55%,型号上均属于凝胶型阳离子交换树脂,在多项树脂理化性质上二者具有高度的相似性。001×8树脂相比001×7树脂在嘌呤物质的吸附率上更胜一筹,推测是由于其交联度更高,相比前者有着更高的体积交换容量和更低的含水率,使其对嘌呤物质的吸附效果更佳。因此,选择001×8树脂作为鸡汤中嘌呤物质的吸附剂进行后续研究。

2.2 树脂表征分析

2.2.1 SEM

SEM是一种较常用的观测吸附剂表面形貌表征的手段。001×8树脂在不同放大倍数下的扫描电镜图见图2,其中a、c放大倍数为200倍,b、d放大倍数为2 000倍。

图2 001×8树脂的SEM图Fig.2 SEM images of 001×8 resin注:a、b为吸附前;c、d为吸附后。

由图2可知,在嘌呤鸡汤体系中树脂吸附前后的表面形态发生显著变化,树脂表面由光滑变得粗糙,出现不规则带状物,说明鸡汤中部分物质被吸附而附着于树脂表面,001×8离子交换树脂对鸡汤体系具有较好的吸附作用。

2.2.2 FT-IR

001×8树脂对鸡汤中嘌呤物质吸附前后的FT-IR图见图3。

图3 001×8树脂吸附前后的FT-IR 图Fig.3 FT-IR spectra of 001×8 resin before and after adsorption

2.3 单因素实验结果分析

2.3.1 树脂用量对鸡汤嘌呤的影响

由图4可知,001×8树脂用量增加过程中,前期随着树脂用量的增加吸附率呈现快速增加的趋势;当树脂用量增加到3 g后,继续增加树脂用量对嘌呤吸附率的提升有限。从吸附量Qe 的变化可以看出,树脂用量的增大固然会提供更多的活性吸附位点从而提升吸附率,但吸附容量的利用程度也随树脂用量的增加而降低。确定一个合适的树脂用量在考虑嘌呤吸附率的同时也应顾及到经济适用性,故采用3 g的树脂用量进行后续优化。

图4 树脂用量对嘌呤吸附率及吸附容量的影响Fig.4 Effect of resin dosage on the adsorption rate and adsorption capacity of purine

2.3.2 吸附时间对鸡汤嘌呤的影响

由图5可知,嘌呤吸附率随反应时间的延长而提升。反应前期吸附快速进行,这一阶段的推动力主要源于固-液两相较大的嘌呤浓度差以及离子交换树脂001×8前期存在的大量空白吸附位点[29]。反应时间在4 h后树脂表面的活性吸附位点减少,固-液两相嘌呤浓度差趋近动态平衡,树脂的嘌呤吸附率增加趋近于零,此时继续增加反应时间对嘌呤吸附率已经难以提升,故吸附时间定为4 h。

图5 树脂处理时间对嘌呤吸附率的影响Fig.5 Effect of resin treatment time on the adsorption rate of purine

2.3.3 吸附温度对鸡汤嘌呤的影响

由图6可知,整体上温度的升高对嘌呤物质的吸附过程有所阻碍。推测树脂对嘌呤的吸附是放热反应,但温度过低也会增加吸附剂与吸附质之间的传质阻力[28],影响吸附反应的发生。因此,一味地提升或降低温度都无法达到树脂吸附条件的最优值,故采用20 ℃进行后续优化。

图6 吸附温度对嘌呤吸附率的影响Fig.6 Effect of adsorption temperature on the adsorption rate of purine

2.3.4 振荡速度对鸡汤嘌呤的影响

由图7可知,一定范围内振荡速度的提高能有效地提前吸附平衡的时间。在转速较低时,溶液中部分树脂沉淀在瓶底,与鸡汤中的嘌呤物质得不到充分接触,导致吸附速率较慢。随着转速的提高,树脂与嘌呤物质的接触频率得到明显提升,吸附平衡的时间也随之提前;之后继续增加振荡速度对吸附促进无明显效果;同时过高的振荡速度可能会导致树脂的空间结构破裂,阻碍嘌呤的吸附。振荡速度的提升也会提升工业化的成本,故振荡速度采用120 r/min。

图7 振荡速度对嘌呤吸附率的影响Fig.7 Effect of oscillation velocity on the adsorption rate of purine

2.4 响应面优化实验

2.4.1 响应面实验结果与方差分析

以崇仁麻鸡汤的嘌呤去除率为评价指标,在单因素实验的基础上,采用 Box-Behnken实验设计,对树脂用量(A)、吸附时间(B)、吸附温度(C)、振荡速度(D)进行响应面优化实验,实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

通过 Design-Expert对表2中的数据进行处理分析,得到回归方程:Y=64.98+3.25A+0.37B-0.43C+0.34D-0.093AB+0.15AC+0.065AD-0.44BC-0.033CD-1.63A2-0.14B2-0.93C2-0.15D2。

对该响应面回归模型进行方差分析,结果见表3。

表3 响应面回归模型及方差分析Table 3 Response surface regression model and variance analysis

由表3可知,模型的P值< 0.000 1,表明模型高度显著。失拟项的P值=0.200 6>0.05(不显著),说明该响应面模型误差小。R2=0.988 5,RAdj2=0.977 1,说明模型的拟合度较高,只有2.29%的情况该模型无法解释。通过比较响应面中F值与P值大小可知,4个因素对鸡汤中嘌呤物质去除率的影响大小为A>C>B>D。

2.4.2 响应面分析与最佳优化条件的确定

在3D图中,单因素所对应的曲线的陡峭程度反映了其对响应值的影响程度。由图8可知,鸡汤嘌呤物质去除率的优化工艺中树脂用量的影响>吸附温度的影响>吸附时间的影响>振荡速度的影响,与前面方差分析结果一致。

图8 各因素交互作用的响应面图Fig.8 Response surface diagrams of interaction of various factors

通过 Design-Expert 8.0分析处理得到鸡汤嘌呤物质去除率的最佳反应条件为树脂用量4 g、吸附时间4.4 h、吸附温度15.4 ℃、振荡速度120 r/min,在此条件下测得树脂对鸡汤嘌呤的去除率为66.7%,与预测结果相接近,表明建立的回归模型对001×8树脂用于鸡汤嘌呤物质去除效果影响的分析是准确可靠的。

2.5 树脂再生和重复利用分析

由图9可知,对001×8树脂进行10次吸附-洗脱重复实验后,树脂对鸡汤嘌呤的去除率由最初的66.7%下降至62.3%,树脂在吸附-洗脱过程中对数值小幅降低,可能是由于每次再生过程都有微量的嘌呤物质未被解吸,导致可用的活性位点略有降低。总体来说,经过10次吸附-洗脱实验,树脂对鸡汤嘌呤的去除率仍在60%以上,表明001×8树脂具有很好的再生和重复利用效果,适合多次使用,具有较高的应用价值。

图9 树脂的再生循环次数Fig.9 Regeneration cycle times of resin

3 结论

实验先以嘌呤去除率为指标筛选适合降低崇仁麻鸡汤嘌呤的树脂,经SEM扫描电镜及FT-IR红外光谱探测,相比吸附前的树脂,吸附后的树脂红外光谱图新增嘌呤的特征吸收峰,树脂表面由光滑变得粗糙且出现较多不规则带状物,验证了001×8树脂对嘌呤物质具有特异性吸附作用,确定001×8离子交换树脂作为后续研究树脂。然后应用单因素实验确定了各个因素的最佳条件,通过响应面实验确定了4个因素对崇仁麻鸡汤嘌呤去除率的影响大小为树脂用量>吸附温度>吸附时间>振荡速度。得到嘌呤吸附工艺条件为树脂用量4 g、吸附时间4.4 h、吸附温度15.4 ℃、振荡速度120 r/min,此时树脂对鸡汤中嘌呤的吸附率可达65%以上。在此条件下考察树脂的再生和重复利用性,经过10 次吸附-脱附实验,吸附率与脱附率依然保持在较高水平,表明 001×8树脂具有很好的再生和重复利用效果,在嘌呤的去除应用中具有很好的工业使用性能及使用寿命。