小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

马燕斌,李换丽,文 晋,王 霞,周仙婷,王新胜

(1.山西农业大学/山西省农业科学院棉花研究所,山西运城 044000;2.运城学院,山西运城 044000)

土壤盐碱化等非生物胁迫是导致小麦等农作物减产的主要因素之一,土壤中过高的钠离子浓度会破坏胞内的离子平衡,造成作物体内的代谢途径紊乱,从而抑制其生长。为降低盐碱逆境对农作物产量的影响,除改良土壤外,培育耐盐碱农作物品种也可有效抵御土壤盐碱化等不利影响,进而在一定程度上稳定农作物产量。多年来,传统遗传育种与分子改良相结合极大地促进了研究人员选育具有耐盐碱、耐旱等特性种质资源的效率[1-2]。

近年来,作物中多种耐旱、耐盐碱的基因被克隆鉴定并证实有助于改良作物的耐逆特性。H+转运无机焦磷酸酶(H+-PPase,TVP)是一种广泛存在于生物体内的H+转运酶,可作为调解细胞酸度的质子泵,驱动各种离子在液泡内的区隔化,同时也参与了调解植物生长素的运输,在植物环境耐受性、生长发育过程中都可能起到了作用[3]。有报道称,大豆GmVP1基因能提高转基因大豆发状根在一定条件下对盐胁迫的反应[4];TPSP融合基因在小麦中的表达可表现出较强的耐旱性[5];烟草中敲除NtMYB68转录因子能改善烟叶中紫黄质的堆积,促进脱落酸的合成,从而改善烟株的抗旱性[6];拟南芥中过表达白菜Bp-NFYA5、番茄sly-miR397基因可以提高其干旱耐受性[7-8];外源基因玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的过表达,可使玉米耐旱性增强[9];GhPNP1 可通过cGMP 信号途径正向调解棉花对干旱的耐受性[10];大豆中的BADH基因也表现出较强的抗旱性[11];此外,植物耐旱密切相关的还有DREB类等基因[12-13];细胞质膜蛋白SOS1和液泡膜蛋白NHX协同作用,使胞质内维持低浓度盐离子,从而提高了植物的抗盐性[14-16]。综上所述,各类不同基因的研究极大地丰富了耐旱、盐碱基因研究的理论基础,同时也说明作物耐旱、盐碱机理可能具有更复杂的多途径调控网络。因此,还需对植物的耐盐、耐旱性进一步探索,从更多的抗逆性作物着手,挖掘更多相关基因,从细胞、组织和整体水平上阐释植物耐干旱、盐胁迫的信号调控机制,进而为作物的遗传改良奠定基础。现有的研究已有很多关注小麦抗逆材料的创制及其分子机制的解析,笔者以小麦耐旱品种晋麦47和舜麦1718为材料,对其TVP1基因进行克隆鉴定,并利用生物信息学对该蛋白进行理化性质、跨膜结构、保守结构域和发育进化等方面进行分析,旨在为进一步研究该基因的功能与机理打下基础,同时也为利用该类基因进行植物耐逆优良种质选育提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试材料晋麦47(JM47)、舜麦1718(SM1718)均为山西省农业科学院棉花研究所国审品种,种植于山西省农业科学院棉花研究所试验田。

1.2 材料处理将晋麦47(JM47)、舜麦1718(SM1718)2种品种小麦籽粒浸泡在经过高压灭菌的蒸馏水中,过夜萌发,次日挑选生长状态一致饱满的种子,播种于土壤条件相同的花盆中,在22 ℃恒温培养箱中进行培养,长日照7 d,取苗样液氮速冻,于-80 ℃保存,供DNA提取之用。小麦在温室盆栽中生长至幼穗阶段时,取根、茎、叶、穗4个组织样品于无RNA酶离心管中,液氮速冻以备RNA提取。

1.3 总DNA提取、RNA提取和cDNA制备DNA按照GENEOUTTM Plant DNA Isolation Kit (LABGENE, 上海)试剂盒的说明书进行提取,-20 ℃保存。小麦材料及其不同组织样品在液氮低温下冷冻磨成样品,分别称取约0.1 g样品粉末,加入Trizol试剂(Invitrogen,USA)进行RNA提取,整个试验过程严格按照操作要求进行,避免RNase污染。利用分光光度计测定各样品RNA浓度、纯度后,以RNA为模板,参考RNA反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription Mix, Oligo(dT) (Promega, 上海)说明书,合成cDNA第1链,于-20 ℃冰箱保存。

1.4TaTVP1基因的克隆从NCBI数据库下载TaTVP1 (AY296911.1)基因CDS序列,利用Primer Premier 6.0软件根据该基因保守序列设计克隆特异性引物,引物由北京奥科生物科技公司合成,序列分别为TaTVP1-F:5′-CATGGCGATCCTCGGG-3′,TaTVP1-R: 5′-CTAGATGTACTTGAAC-3′。以晋麦47和舜麦1718幼苗的cDNA分别为模板,利用ExTaq酶(Takara,上海)扩增TaTVP1基因的全长序列。反应条件为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸2 min,终延伸10 min,30个循环。PCR产物经浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测,按照DNA纯化回收试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)说明书回收片段,进行克隆。

1.5 蛋白结构分析利用SOSUI软件预测分析TaTVP1蛋白的跨膜结构域;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)对TaTVP1蛋白的三维结构进行在线预测。

1.6 进化关系分析从NCBI网站blastp分析并下载与TaTVP1氨基酸序列同源性较高的其他物种的氨基酸序列,利用Clustal工具进行多序列比对,MEGA 5.0软件分析进化关系,利用Neighbor-Joining算法构建进化树,Bootstrap分析1 000次。

1.7TaTVP1基因的组织表达分析利用Beacon Designer 软件,参照TaTVP1基因序列,选择基因保守区设计特异性的荧光定量引物,内参基因为小麦Actin基因引物(表1)。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅢ (Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)说明书,采用Applied Biosystems Step OnePlusTM 仪扩增,PCR体系25 μL,扩增程序为: 95 ℃预变性4 min,95 ℃变性5 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸10 s,循环40次。设置3次重复。数据处理采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 定量PCR分析使用引物序列

2 结果与分析

2.1TaTVP1基因全长的克隆以晋麦47(JM47)、舜麦1718(SM1718)的cDNA为模板,扩增克隆均得到全长2 000余bp的TaTVP1基因片段(图1),纯化回收产物,连接克隆载体pMD19-T转化至Trans-T1感受态细胞,随机挑取长势较好的菌落,经菌液PCR检测,筛选出阳性克隆,送至北京奥科生物科技公司测序。结果显示,TaTVP1基因序列全长2 289 bp,推测编码762个氨基酸。

注:M.5 000 DNA Marker;1.晋麦47材料扩增的TaTVP1片段;2.舜麦1718扩增的TaTVP1片段。

2.2 小麦TaTVP1的系统进化树分析通过NCBI网站中blastp在线工具对TaTVP1氨基酸序列进行同源性搜索,选取相似性较高的多个作物TVP1氨基酸序列与TaTVP1进行比较分析,利用MEGA软件构建系统进化树,结果显示(图2),各作物TVP1蛋白在进化中分化成两大类,一类是大豆、拟南芥、棉花、烟草聚为一簇的双子叶植物TVP1 Ⅰ类;另一类是小麦、玉米、水稻、青稞、大麦草TVP1聚为一簇的Ⅱ 类,其中小麦TVP1蛋白与水稻、玉米等禾本科单子叶植物TVP1蛋白的遗传距离最近。这说明TVP1蛋白在单双子叶植物中的遗传分化明显。

2.3 TaTVP1蛋白的跨膜结构预测分析利用SOSUI软件对TaTVP1蛋白进行跨膜结构预测分析,表明TaTVP1蛋白的氨基酸序列包含12个疏水跨膜结构域(图3)。亚结构域分析显示,小麦TVP1蛋白分为2个独立的结构,一个是N端,包含4个疏水的跨膜区域,另一端是C端,包含8个疏水跨膜区域,其多肽链的N端和C端均在膜外。

图3 TaTVP1跨膜结构分析

2.4 TaTVP1跨膜氨基酸序列比对分析小麦TVP1编码762个氨基酸,由该氨基酸序列(图4)包含的12个跨膜结构域(I-XII)序列的分析和比较可知,小麦TVP1与拟南芥、水稻各跨膜区中保守氨基酸一致的分别为10、13、15、19、21、20、13、19、21、19、25及17个,各跨膜区疏水氨基酸的个数依次为16、15、12、13、11、13、14、15、17、13、11及14个。

注:I～XII为分析跨膜序列结果所标示的氨基酸序列,疏水性氨基酸有A丙氨酸、Y酪氨酸、F苯丙氨酸、W色氨酸、V缬氨酸、I异亮氨酸、L亮氨酸和P脯氨酸。

2.5 TaTVP1蛋白三级结构域预测根据前述预测的不同疏水氨基酸跨膜结构,进一步预测TaTVP1蛋白在细胞内形成的功能结构,分别利用不同长度的氨基酸序列进行模型匹配比较分析可知,全长TaTVP1氨基酸可折叠形成膜结构孔道蛋白高级结构(图5A),该孔道具有较清晰的管状结构;其中N段300氨基酸(图5B)与C端301～762 aa(图5C)能够形成独立的孔道结构组成模型。

注:A、B、C、D分别表示氨基酸序列为全长、N端1～300 aa、C端301～762 aa及241～762 aa。

2.6TaTVP1在小麦不同组织的表达分析选用耐旱品种晋麦47和水地品种舜麦1718为材料,分析TaTVP1基因在根、茎、叶、穗4个不同组织的表达水平,并比较该基因在2个品种中不同组织的表达水平。定量PCR结果显示(图6),TaTVP1在不同组织中的表达水平存在明显差异,在根与茎中的表达量较高,叶、穗组织中表达量较低。在2个品种间,晋麦47的茎中表达量最高,高出根中表达量的1.63倍,穗中表达量最低;而舜麦1718茎中TaTVP1表达量与根中的表达量差异很小,叶、穗中的表达量较低。

图6 TaTVP1在小麦不同组织中的表达量

3 结论与讨论

植物对逆境非生物胁迫的响应过程十分复杂,涉及生理、生化特性的多种过程。在植物中,H+转运无机焦磷酸酶与NHX逆向转运蛋白可以稳定胞质内的酸碱度,使胞质内的Na+维持在较低浓度,进而增强植物的耐盐、耐旱性[15-16]。该研究中克隆所获得的小麦TVP1基因的核苷酸序列与参考基因序列存在一些单核苷酸差异,这可能是不同品种小麦之间单核苷酸多态性造成的。而且,六倍体小麦中含有A、B、D 3个染色体组,TVP1在不同染色体组中还存有同源基因[17]。TaTVP1蛋白中12个跨膜区域中的疏水氨基酸序列具有较高的一致性,表明该蛋白在进化过程中,结构域遗传保守性较高,也预示着其在细胞中的功能不可替代。有研究报道,拟南芥NHX肽链C末端的缺失可引起Na+/H+交换活性发生明显变化[18],表明C末端与Na+/H+交换活性密切相关,分析显示TVP1的C末端位于膜外的氨基酸序列较长,且亲水氨基酸含量较高,推测该序列可能参与胞质内的离子交换,影响Na+/H+的交换活性,同时,TVP1蛋白三级结构具有明显的孔道结构,也预示与其具有的质子泵作用密切相关,但具体的行使功能过程需要进一步探究。

研究表明,植物耐盐性与耐旱性具有一定的相关性,耐旱材料往往也表现出较好的耐盐性。过表达液泡H+焦磷酸酶的转基因植物对高浓度NaCl的耐受性更强,对干旱的耐受性也更强,由此可知该基因有助于提高植株的耐旱和耐盐性[19-20]。而在各种非生物胁迫下,许多转H+焦磷酸酶基因植物的茎和根生物产量增加[21-24]。该研究组织特异性表达结果中,该基因在根、茎中的相对表达量明显高于叶、穗中,这可能与TVP1在不同组织中抗逆性的作用特征有关;耐旱品种晋麦47与舜麦1718相比,茎部表达量又明显高于根部,这种表达模式可能与晋麦47表现出优良的耐旱性特征相关,后续可以通过转化该基因等方法对其功能进行进一步阐释。该研究获得并分析了小麦TVP1基因的核苷酸与氨基酸序列,对其表达模式也进行了研究。后期将在小麦中过量表达TVP1基因,探究其耐旱、耐盐功能,并进一步阐释其机制,从而为培育耐逆优良种质的植物提供理论基础。