梭鲈ghrh基因序列特征及其在大小个体间差异表达分析

周 佳，孙志鹏，吉宇丹，吕伟华，曹顶臣，鲁翠云，刘天奇，郑先虎

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150070；2.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone，ghrh)是由下丘脑神经元分泌的一种多肽类激素，是目前已知促进生长激素合成和分泌的主要激素之一，在脊椎动物的生长、代谢、繁殖、免疫调节等生物学过程发挥着重要作用[1-3]。有研究表明向动物体内注射ghrh或ghrh类似物，可以加快其生长速率，提高生产性能[4]。近些年，国内外学者对水产动物进行了ghrh基因表达特征的研究，结果表明，该基因在各组织的调控模式因物种的不同而存在差异，但ghrh基因一般在脑中高表达[5-8]，其基因表达量的高低影响着鱼类生长的快慢[9-10]。此外，ghrh基因水平变化也受温度[11]、性别[12]、外源激素[13]、光谱[14]等因素的调控，进而影响鱼类的生长性能。

梭鲈(Sanderlucioperca)属于鲈形目(Perciformes)鲈科(Percidae)梭鲈属(Sander)，在国外主要分布于黑海、咸海、里海及波罗的水系，中国则主要分布于新疆的伊犁河、额尔齐斯河和黑龙江水系。梭鲈具有营养丰富，肉质优良、抗病力强、生长速度快等特点，是我国重要的淡水名优养殖鱼类[15]。近几年，国内外对梭鲈的研究主要在群体遗传多样性[16]、增养殖[17]、饲料与营养[18-19]、病害[20]等方面。但关于梭鲈生长性状遗传研究的文章较少，韩晓飞[21]验证了8个微卫星位点与梭鲈生长性状呈显著相关；TENG等[22]克隆了胰岛素样生长因子Ⅰ/Ⅱ(insulin-like growth factors，IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)和生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)基因，并在IGF-Ⅱ中获得1个与体重显著相关的SNP位点。由于未经过系统选育，梭鲈养殖过程中出现个体大小差异显著，导致出塘规格悬殊，一定程度上影响了梭鲈养殖业的发展。因此，开展梭鲈生长性状调控机制及遗传改良研究具有重要的实践意义。本研究以生长轴ghrh基因入手，克隆获得了ghrh基因cDNA全长序列并分析了序列特征，研究了其在梭鲈各组织的表达分布，分析了其表达量与梭鲈生长之间的相关性，旨在为梭鲈生长性状的分子选育研究提供候选基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验梭鲈取自黑龙江水产研究所呼兰试验场，选取同池塘养殖条件下的5尾1龄鱼，体质量为210～240 g，取心、肝、脾、脑、垂体、肌肉、肠、胃、皮肤、鳃组织，置于液氮中速冻保存。随机选取同批次繁殖、同池塘养殖环境下5月龄梭鲈500尾，挑选体质量极大和极小个体各10尾，极小组[体长(98.42±3.81)mm，体质量(8.28±1.12)g]和极大组[体长(171.6±10.6)mm，体质量(49.36±7.61)g]，将取得的组织(脑、肌肉、肝)置于液氮中冷冻保存。总RNA提取按照ThermoFisher公司提供的TRIzol Reagent试剂盒说明书进行操作；利用NanoDropTM 8000分光光度计和1.2%的琼脂糖电泳对RNA样品进行浓度和纯度检测。

1.2 基因克隆

以脑RNA为模板，根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书反转录为cDNA第一链(Takara，日本)。参照GenBank中已登录的亲缘关系较近的硬骨鱼类ghrh基因序列，选择保守区域和NCBI中发布的梭鲈转录组数据(登录号：XM_036002601)进行序列比对，获得梭鲈ghrh基因的部分cDNA序列并设计引物进行序列验证(表1)。根据已获得梭鲈ghrh基因的保守区域的序列设计RACE扩增引物(表1)，按照SMARTer®RACE5′/3′试剂盒(Takara，日本)说明书构建RACE文库，SeqAmpTM DNA Polymerase(Takara，日本)试剂盒进行巢式PCR扩增。RACE第一轮：反应体系为10 μL，5′-GSP或3′-GSP 1 μL，10×UPM 1.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 0.2 μL，2×SeqAmp Buffer 5.0 μL，PCR-Grade H2O 3.1 μL，模板0.5 μL。反应程序为：94 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；70 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃，2 min；25 cycles。RACE第二轮：取第一轮产物5.0 μL加入245.0 μL EDTA Buffer稀释，作为二轮反应模板。反应体系为50.0 μL：SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，PCR-Grade H2O 19.5 μL，UPMs 1.0 μL，nGSP1.0 μL，模板为2.5 μL。反应程序为：94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃ 2 min；25 cycles。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，对目的条带切胶后按照琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化目的产物(康为世纪，上海)，将纯化后的PCR产物连接至pMDTM19-T载体，转化至大肠杆菌感受态DH5α，涂板，筛选阳性克隆送到苏州金唯智生物科技有限公司完成测序。将测序结果使用BLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，DNAMAN软件分析，Staden 1.7软件进行拼接，最终获得ghrh基因的全长cDNA序列。

1.3 蛋白质生物信息学分析及系统进化树构建

使用DNAMAN软件查找基因的开放阅读框；使用在线软件ExPASy-Protparam Tool(https：//web.expasy.org/protparam/)预测蛋白理化性质；TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件预测蛋白质是否跨膜；Signalp-4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测蛋白质信号肽；Simple Modular Architecture Research Tool(http：//smart.embl-heidelberg.de/smart)工具预测蛋白结构域特征；SOMAP(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)蛋白质二级结构预测。DNAMAN软件进行氨基酸序列比对分析；利用MEG-A 7.0和Clustal 2.1软件，采用邻接法(Neighbor-Joining method，NJ)构建系统进化树，B-ootsrap(1 000次)得出各分支置信度。

1.4 基因表达特征分析

2 结果与分析

2.1 ghrh基因的克隆和序列分析

梭鲈ghrh基因cDNA全长为1 100 bp(GenBank登录号：MZ313192)，5′端非编码区(5′-UTR)和3′端非编码区(3′-UTR)序列分别为494 bp和180 bp，开放阅读框为426 bp，编码141个氨基酸，带有典型的多聚腺苷酸化信号序列(ATTAAA)和多聚ploy(A)尾巴(图1)；推导的ghrh蛋白质分子式为C701H1139N211O213S7，分子质量16.15 kDa，理论PI值为9.82，蛋白质的不稳定系数和亲水系数分别为46.34、-0.637，是不稳定且亲水性蛋白质；该蛋白无跨膜结构域，属于胞外分泌蛋白；ghrh氨基酸序列N端含有1个18个氨基酸组成的信号肽序列(1～18 aa)和一个GLUCA保守结构域(65～91 aa)(图1)；梭鲈ghrh蛋白质的二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成，α螺旋占比44.68%，无规则卷曲占比47.52%，延伸链占比7.8%(图2)。

图1 梭鲈ghrh 基因cDNA序列及其推导氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence of S.lucioperca ghrh gene and deduced amino acid sequence下划线表示ghrh前体蛋白信号肽，灰色阴影为GLUCA结构域；黄色阴影表示加尾信号，“*”表示终止密码子。

图2 梭鲈ghrh蛋白二级结构预测Fig.2 The second structure of S.lucioperca ghrh protein蓝色：α螺旋，红色：延伸链；黄色：无规则卷曲。

2.2 ghrh氨基酸序列比对及系统进化树分析

梭鲈ghrh同其他脊椎动物ghrh氨基酸序列比对结果显示，梭鲈与同为鲈科鱼类的河鲈、黄金鲈同源性最高，相似性分别为95.04%、94.33%，亲缘关系较近，同模式生物斑马鱼(Daniorerio)、小鼠(Musmusculus)的相似性分别为74%、41.54%，亲缘关系较远，且N端均有一个保守的结构域(图3)。

图3 梭鲈ghrh与其他物种氨基酸序列的同源性多重比较Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of S.lucioperca ghrh with the corresponding sequence from other species序列中相同氨基酸残基用黑色背景表示，同源性超过75%用粉红色背景表示，同源性超过50% 用浅蓝色背景表示。

系统发育树结果显示，可分为鱼类、哺乳类两大支，其中梭鲈先与同为鲈科鱼类的黄金鲈(Percaflavescens)、河鲈(P.fluviatilis)聚为一小支，后与橙胸镖鲈(Etheostomaspectabile)、尖吻鲈(Latescalcarifer)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)等鲈形目聚为一个分支，最后与鲑形目的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鲑(Salmosalar)、鲤形目的斑马鱼和鲤鱼(Cyprinuscarpio)聚为一大支，而小鼠和人(Homosapiens)等哺乳动物则聚为另一大支(图4)。

图4 不同物种间ghrh蛋白序列N-J系统进化树Fig.4 N-J phylogenetic tree of ghrh protein sequence in different species

2.3 ghrh基因组DNA序列结构分析

根据NCBI数据库梭鲈ghrh基因组序列可知，ghrh基因组DNA全长4 279 bp(GenBank登录号：116037223)。通过比较研究斑马鱼、小鼠和人的基因组DNA结构，结合已克隆获得的ghrh基因CDS区序列，发现梭鲈ghrh基因组包含5个外显子和4个内含子，而斑马鱼、人和小鼠有4个外显子和3个内含子。斑马鱼、小鼠和人的ghrh基因组长度分别是梭鲈的21倍、4.5倍和2.5倍(图5)。梭鲈ghrh基因外显子长度分别77、105、105、126、13 bp，内含子分别为740、528、115、134 bp。

图5 ghrh基因组结构分析Fig.5 Genomic organization of ghrh

2.4 ghrh基因在不同组织中表达特征分析

本研究采用实时荧光定量PCR技术检测了ghrh基因在梭鲈10个组织中的表达情况。ghrh基因在所有检测组织中均有表达，表达量从高到低依次是脑、垂体、鳃、脾、胃、肝、肠、心、皮肤、肌肉。脑和垂体中的表达量显著高于其他组织且差异显著。皮肤和肌肉中表达量相当，差异不显著(图6)。

图6 ghrh基因在梭鲈各组织的表达特征Fig.6 The expression of ghrh in different tissues of S.lucioperca.小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。以肌肉为参考样本，

2.5 ghrh基因在生长差异个体间表达分析

通过对梭鲈极端个体体长、体质量等生长数据进行比较分析，显示梭鲈极大组个体的体长、体质量均极显著高于极小组(图7)；采用实时荧光定量PCR技术对比分析了ghrh基因在梭鲈生长极端差异两组间的脑、肝和肌肉组织中表达情况，结果表明ghrh基因表达量均为极大组高于极小组，与生长性状差异比较结果相符；其中该基因在脑组织中的表达量为极大组显著高于极小组，但在肝、肌肉组织中差异不显著(图8)。

图7 梭鲈大小个体间生长性状比较分析Fig.7 Analysis of extreme individual growth traits of S.lucioperca**：极显著性差异(P<0.

图8 ghrh 基因在梭鲈大小个体间的差异表达分析Fig.8 The different expression level of ghrh in extreme individuals of S.lucioperca.*：显著性差异(P<0.05)；ns：无显著差异。以极大组肝为参考样本，

3 讨论

3.1 ghrh基因序列特征的生物信息学分析

ghrh最主要的生物学功能是促进垂体中生长激素的合成和释放[23]。本研究中梭鲈ghrh基因N端存在一个保守的GLUCA结构域(65～91aa)，具有典型的胰高血糖素类似激素的特征，该结构域是发挥生物学活性的重要位点。多重氨基酸序列比对结果显示，哺乳动物和鱼类都存在GLUCA结构域，这表明该结构域在不同物种间具有高度保守性。系统进化树分析显示，梭鲈ghrh的氨基酸序列在进化上与同为鲈科鱼类的黄金鲈、河鲈亲缘关系最近且聚为一支，这表明该基因在进化的过程中较为保守；而其他的鲤形目、鲑形目、哺乳动物各聚为一支，推测与它们核苷酸变异大且亲缘关系较远有关[24]。这与传统形态学分类较为一致，该发育系统进化树较真实地反映了该物种进化的关系。基因结构比较分析显示，梭鲈ghrh基因有5个外显子和4个内含子，这与大口黑鲈(Micropterussalmoides)[25]、草鱼(Ctenopharyngodonidella)[26]的外显子和内含子数目一致。斑马鱼、人和小鼠有4个外显子和3个内含子，这与梭鲈外显子数目不一致，这表明ghrh基因结构组成具有物种特异性，可能与物种进化速率不同有关。

3.2 ghrh基因在不同组织中的表达分析

ghrh基因作为生长轴上的关键生长调控因子，其在组织中的分布已有一些在不同物种间的研究。如在哺乳动物中，ghrh基因主要在下丘脑和大脑中高表达，在后脑中低表达[27]。金鱼(Carassiusauratus)[28]、大口黑鲈[25]中ghrh表达模式与哺乳动物相似，主要在大脑中高表达。这与本研究中梭鲈ghrh在脑中表达水平最高的结果一致，这表明ghrh对鱼类神经内分泌系统有重要调节作用。除脑以外，ghrh基因在梭鲈的垂体、心、肝、肌肉、皮肤、鳃、肠等其他组织中均有表达且具有组织表达差异性，而布氏鲳鲹(Trachinotusblochii)[5]、大刺鳅(Mastacembelusarmatus)[6]、露斯塔野鲮(Labeorohita)[29]等鱼类在脑、肌肉、肝、鳃等少数组织中有表达，可能是物种间的差异导致表达模式不同。本研究ghrh基因在梭鲈垂体中表达量较高，然而在点带石斑鱼[8]垂体中不表达，本研究结果与这不一致，推测本研究一龄梭鲈正处于生长旺盛时期，需通过垂体中ghrh表达产物刺激垂体释放大量的gh来维持鱼类的生长需要。本研究中梭鲈ghrh基因在鳃中表达量也较高，这与牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]的研究结果一致，推测ghrh基因可能通过参与渗透压调节等生理功能从而调控鱼类生长，具体机理还需进一步深入研究。

3.3 ghrh基因在生长差异个体间表达分析

鱼类的生长主要依赖体内的生长激素，而生长激素的产生受下丘脑分泌的ghrh影响，研究表明注射外源ghrh6 h后可显著提高大刺鳅垂体中gh的表达水平，ghrh对鱼类生长发育起正向调控作用[6]。RAM等[9]研究发现极大组鲶(Clariasmagur)脑中ghrh基因表达量高于极小组，林明德等[10]研究发现快速生长的褐点石斑鱼(E.fuscoguttatus)F1子代脑中ghrh基因表达量高于生长慢速的亲本。这与本研究中梭鲈极大组脑中ghrh基因表达量显著高于极小组的结果相一致(P<0.05)，推测ghrh通过神经内分泌系统影响鱼类的生长速度。与之相反的是，JI等[12]研究发现9～12月龄半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)在生长慢的雄鱼脑中ghrh的表达量显著高于生长快的雌鱼(P<0.05)，JIANG等[30]研究发现金钱鱼(Scatophagusargus)生长慢的雄鱼下丘脑中ghrh基因表达量显著高于生长快的雌鱼(P<0.05)，这一结果的出现可能是gh的缺乏导致雄鱼中产生负反馈而调节ghrh的高表达。以上研究说明了生长发育是复杂的生物学过程，需要更多相关基因共同的调节。

肝是促进鱼类生长重要的靶器官，ghrh通过刺激垂体释放gh，gh通过与肝细胞表面生长激素受体结合，直接促进细胞生长，或通过启动细胞内信号传导机制诱导igfs表达间接促进组织细胞生长，进而促进鱼类生长[23]。RAM等[31]研究发现极大组鲶鱼肝中ghrh基因表达量高于极小组，这与本研究中梭鲈极大组肝中ghrh基因表达量显著高于极小组的结果相一致，这表明肝中ghrh的表达水平也可影响鱼类的生长速度。鱼类的生长主要依赖肌肉质量的增加，ghrh基因可以促进肌肉组织的增殖与分化，从而促进动物自身的生长与发育。戴建威等[31]研究发现将慢病毒载体介导的ghrh基因注射到小鼠肌肉组织，促进体内gh释放，小鼠的日增重得到了显著性的提高。在本研究中，ghrh基因在极大组肌肉组织中的表达量要显著高于极小组，这表明ghrh基因在梭鲈肌肉生长发育过程中发挥重要作用。综上所述，梭鲈极端个体间各组织ghrh基因表达水平与梭鲈的生长性状呈正相关，ghrh对梭鲈的生长发育发挥着重要作用。因此，ghrh基因在梭鲈的分子育种中可作为生长性状研究的候选基因进行应用。