膝三针对膝骨关节炎模型大鼠软骨形态学及行为学改变的影响

李仁重 孙 奎

1.安徽中医药大学第二临床医学院，安徽合肥 230061；2.安徽中医药大学第二附属医院 安徽省针灸医院骨二科，安徽合肥 230061

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种慢性退行性关节疾病，涉及关节软骨和滑膜关节周围的组织，表现为疼痛、肿胀、僵硬和功能障碍，其发病与肥胖、性别、衰老等多种因素有关[1]。KOA 的患病率、致残率高，60 岁以上人群的患病率可达50%，致残率高达53%，降低了老年人的生活质量，同时增加了社会的经济负担[2]。目前西医主要采用以减轻疼痛、消炎等控制症状为主的治疗方法，长期服用西药可能会带来诸多不良反应，且无明显的软骨保护作用[3]。中医治疗KOA 具有效果全面和安全可靠的独特优势，而针刺又是中医治疗KOA 较为有效的方法之一，并以其疗效显著、操作简便、经济安全、防治结合而受到广大患者的青睐[4]。本研究在前期工作的基础上，观察膝三针对KOA 模型大鼠行为学和软骨组织的形态学的影响，为针刺治疗该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

28 只3～4 周龄雄性SPF 级SD 大鼠，体重180～220 g[实验动物合格证号：110322211102387552，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，北京华阜康生物科技股份有限公司]，室温（20±1）℃、湿度（55±15）%、昼夜各12 h 更替、自由进食水适应性饲养3 d。采用随机数字表法将其分为空白组、模型组各8 只，针刺组、西药组各6 只。空白组和模型组各随机取2 只用于模型验证。实验中对动物的处理符合中国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》（2021093001）。

1.2 试剂和仪器

主要试剂：双氯芬酸二乙胺乳胶剂（批准文号：H19990291，北京诺华制药有限公司）；无菌针灸针φ0.3 mm×40.0 mm（注册证号：20172270468，北京珞亚山川医疗器械有限公司）；苏木精染液（批号：ZLI-961，北京中杉金桥生物技术有限公司）；伊红染色液（批号：G1100）、Scott 蓝化液（批号：G1865）均来自Solarbio 公司；超净高级封片胶（批号：YZB，BASO公司）。

主要仪器：ABM-100 型小动物麻醉（上海玉研科学仪器有限公司）；BYC-310 型药品冷藏柜（山东博科生物技术有限公司）；CX43 型显微镜（OLYMPUS）；2235 型切片机（德国，Leica）；HGZF-101-1 型电热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.3 模型的建立

除空白组外，其他三组大鼠参照陈益丹等[5]前交叉韧带横断术方法制备KOA 模型。4 周后大鼠的左侧后肢出现了肿胀、屈伸功能障碍等现象。从空白组与模型组各随机取2 只大鼠进行左膝关节X 线扫描。与空白组比较，若模型组左膝关节间隙明显变窄，关节面变模糊，部分有融合及骨赘形成，提示造模成功。

1.4 干预方法

①空白组：常规饲养，不予任何干预。②模型组：造模后常规饲养，不予任何干预。③针刺组：造模5 周后进行大鼠左膝关节针刺干预，每天1 次，连续5 d 休息2 d，共治疗3 周。操作：参照《实验针灸学》[6]寻找大鼠左膝关节的内膝眼、犊鼻、鹤顶作为进针点。常规备皮消毒后，选用0.3 mm×40.0 mm 毫针，诸穴均直刺3～5 mm，针尖抵达软骨表面，实际刺激其关节软骨。使用平补平泻捻转手法（捻转角度为90°～180°，速度为60～120 次/min）各30 s 后留针30 min，治疗结束拔针并用无菌棉球按压止血。④西药组：为阳性对照组，左膝局部外搽双氯芬酸二乙胺乳胶剂，与针刺治疗同时进行。

1.5 观察指标与检测方法

①左膝关节X 线扫描：对空白组与模型组选出的大鼠进行麻醉，使用X 线成像系统对大鼠左膝关节进行扫描。②一般情况观察及Lequesne MG 评分：治疗前（4 周后验证造模成功后）及治疗后均由同1名不参与实验的课题组成员进行评估。观察各组大鼠的精神状态、活动情况等，并用Lequesne MG 的膝关节评估方法[7]对大鼠膝关节局部反应（分为4 级）、步态改变（分为4 级）、关节活动范围（分为4 级）及肿胀程度（分为3 级）进行评估，Lequesne MG 评分为4 个指标之和。症状越明显，级别与分数越高。③膝关节软骨大体观察：术后8 周处死各组大鼠，取其膝关节处软骨组织进行大体观察。④苏木精-伊红染色法观察大鼠膝关节软骨细胞形态：将观察后的大鼠膝关节软骨组织用4%中性甲醛溶液固定，用浓度梯度醇脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，切片，显微镜下观察。根据Mankin’s 评分[8]进行评估，评分越高提示软骨破坏越严重。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析或t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左膝关节X 线检查结果

空白组大鼠关节间隙可见，未见骨赘形成，胫骨近端和股骨远端骨结构均匀可见，未发现软骨下硬化和骨囊肿。而模型组大鼠关节间隙变窄，胫骨平台平面出现粗糙，股骨远端出现硬化，有骨赘形成。两组X线情况比较，提示造模成功。见图1。

图1 大鼠膝关节X 线情况比较

2.2 各组大鼠治疗前后Lequesne MG 评分比较

治疗前，模型组Lequesne MG 评分高于空白组（P＜0.05）；治疗后，模型组的Lequesne MG 评分高于空白组（P＜0.05），而针刺组低于模型组（P＜0.05）。治疗后，模型组、针刺组、西药组Lequesne MG 评分低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后Lequesne MG 评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠治疗前后Lequesne MG 评分比较（分，±s）

注与空白组同期比较，aP＜0.05；与模型组同期比较，bP＜0.05。“-”表示无数据。

2.3 膝关节软骨大体观察

肉眼可见空白组大鼠关节软骨表面光滑呈淡蓝色半透明状，无裂纹及软骨缺失，关节间隙未见狭窄，边缘规整，未见明显纤维化及裂纹形成，无软骨下骨外露且无骨赘形成；模型组可见软骨表面粗糙，灰暗失去光泽，关节间隙狭窄，有明显纤维束状改变，软骨软化和软骨下骨外露现象，边缘明显骨赘形成；针刺组可见软骨表面轻微粗糙，略暗淡有光泽，较平滑，有轻微软骨软化及软骨剥脱现象。见图2。

2.4 各组大鼠软骨形态学比较

2.4.1 细胞形态比较 空白组大鼠膝关节软骨表面光滑整齐，表层软骨细胞平坦而小，数量较多，排列整齐，层次清晰，细胞核清晰可见，染色质分布均匀；模型组大鼠膝关节软骨表面有较多裂隙，软骨基质着色不均，软骨面粗糙，表层和中间区域的软骨细胞数量减少且排列紊乱，可见软骨细胞增生与肿胀，细胞核皱缩，潮线模糊、断裂；针刺组大鼠膝关节软骨表面相对整齐，软骨组织结构尚清晰可见，软骨膜附近可见少量成软骨细胞，软骨细胞数量略有增加，排列较有序，潮线染色较浅，结构基本清晰。见图3。

图3 四组软骨细胞苏木精-伊红染色比较（A、B、C、D：40×；E、F、G、H：200×）

2.4.2 软骨组织病理Mankin’s 评分 与空白组比较，模型组评分明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组评分明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠关节软骨Mankin’s 评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠关节软骨Mankin’s 评分比较（分，±s）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

3 讨论

KOA 是一种慢性退行性肌肉骨骼疾病，常因关节劳损、肥胖、机械创伤等多种因素引起。其特点是进行性软骨侵蚀，软骨下骨转换和骨赘形成，以及关节内的其他病理改变[9-10]。中医认为KOA 属于“骨痹”范畴，《素问·长刺节论》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”病因病机多因年老体衰，感受外邪、肝肾亏虚和痰浊瘀血，导致骨失滋养，进而出现筋骨关节及肌肉疼痛、麻木、屈伸不利等症状[11]。

目前KOA 主要以细胞因子、炎症因子、基因表达、信号通路等方面的研究为主[12]。研究发现，KOA 的发生与内质网应激（endoplasmie retieulum stress，ERS）引起的软骨细胞的凋亡有关[13]。ERS 通过激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）在软骨细胞凋亡启动的过程中起着重要的调控作用[14]。PERK 通路是UPR 的一种，在KOA 进展中，ERS 标志物PERK和CHOP 的表达水平增加；CHOP 可通过调节软骨细胞凋亡，进而加速关节软骨退变，损伤软骨组织[15-16]。芮靖琳等[17]发现严重或长时间的ERS 将激活PERKCHOP 信号通路诱导细胞凋亡。KOA 的发生与软骨细胞的凋亡关系密切，而抑制软骨细胞凋亡则能够有效地阻止KOA 的进展[18]。因此，对于PERK-CHOP 信号通路的调控与KOA 病程的发展密切相关。

由于西医治疗KOA 的局限性，故针对中医药治疗KOA 的研究越来越多，中医融合了多种治疗方法，包括针刺[19]。目前，针刺已被广泛接受为一种重要的主流补充和替代疗法，改善膝关节功能，缓解疼痛，延缓关节退化，达到联系脏腑、调整气血、协调阴阳、扶正祛邪的目的，从而防止KOA 的发展[20]。膝三针是在长期临床实践基础上，集历代名医的经验总结出的针对膝关节疾病的疗法，由内膝眼、犊鼻，阴陵泉、阳陵泉及血海、梁丘和鹤顶等穴位组成[21]。其中内膝眼、犊鼻和鹤顶是最常见的压痛点，属于局部取穴，体现了“腧穴所在，主治所及”的选穴原则，具有疏通气血，祛风散寒，通利关节，除痹止痛之功效[22-23]。临床实践发现膝三针疗法能直达膝关节病灶，产生较快的针刺止痛作用[24]。孙奎等[25]选取膝三针的穴位进行针刺，采用WOMAC 问卷、VAS、关节功能评分进行评估，得出了膝三针疗法能较理想的改善膝关节疼痛、僵硬等症状，提高生活能力，防止病情复发。本研究以膝三针疗法为切入点，观察膝三针对KOA 模型大鼠膝关节软骨形态学及行为学的影响。

本研究采用前交叉韧带横断术建立大鼠KOA 模型，HE 染色可见空白组大鼠膝关节软骨基质中软骨细胞和分布均匀，有多个软骨细胞，软骨下有明显潮红；与空白组比较，模型组可见软骨层变薄、软骨表面缺损破坏，软骨细胞较少，Mankin’s 评分明显增加；与模型组比较，针刺组的软骨层更厚，软骨细胞更多，软骨下的组织更清晰，Mankin’s 评分降低，提示针刺可以在一定程度上减少软骨的退变，修复软骨组织的损伤。治疗后针刺组Lequesne MG 评分较模型组明显下降，提示针刺能缓解KOA 的行为学恶化。

由大鼠模拟人类患KOA，如关节功能障碍、疼痛，并引起软骨退化的病理改变，得出膝三针疗法改善了KOA 大鼠的关节活动度与活动步态，有效地减轻了关节痛、功能障碍、变形等，抑制软骨细胞退变，保护了关节软骨，从而达到有效治疗KOA 的作用。膝三针疗法调控PERK-CHOP 信号通路是减少软骨退变、修复软骨组织损伤的可能机制，为进一步的机制研究提供方向。