基于多指标综合评分法优选益气活血解毒合剂的提取工艺

刘 敏 陈丽芳 李京峰 田佳懿 年宏蕾 曾蔚欣

首都医科大学附属北京世纪坛医院药学部，北京 100038

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一，临床表现为四肢末端麻木、蚁行感、针刺样疼痛等，发病率占糖尿病总人数的50%以上[1-3]，严重影响了患者的身心健康及生活质量。益气活血解毒方为首都医科大学附属北京世纪坛医院（以下简称“我院”）临床验方，由黄芪、丹参、当归等药味组成，诸药合用，补中有通，温清并用，共奏益气活血、养血化瘀、通络解毒之功，临床用于治疗糖尿病周围神经病变，效果显著[4-6]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷为处方中君药黄芪的定量指标，具有降低糖尿病大鼠血糖的药理作用[7]；丹酚酸B 为处方中臣药丹参的定量指标，对糖尿病大鼠有降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用[8]。故本研究以君药及臣药指标性成分的含量及浸膏得率为考察指标，采用L9（34）正交实验设计法，优选益气活血解毒合剂的提取工艺，以期为该制剂的进一步研发提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；FA1004B 型万分之一电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；KQ-600DE 型数控超声波清洗仪（上海舒美超声仪器有限公司）；BY-R20 型离心机（四川蜀科仪器有限公司）；SCI-FS 固定式混匀仪（美国赛洛捷克公司）。

1.2 材料

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（纯度98.0%，批号：DST200619-013，成都曼思特生物有限公司），丹酚酸B 对照品（纯度96.6%，批号：111562-201917，中国食品药品检定研究院）；黄芪（批号：2007126）、丹参（批号：2006142）、鸡血藤（批号：2001123）、苏木（批号：2008061）、当归（批号：2003137）、黄连（批号：2010008）购于北京盛世龙药业有限公司，经我院主管中药师年宏蕾鉴定，均符合2020 版《中华人民共和国药典》[9]一部项下有关规定；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件Agilent EClipse C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0～10 min，15%→20%A；10～20 min，20%→30%A；20～25 min，30%A；25～30 min，30%→15%A；流速1.0 ml/min，柱温35℃，进样量10 μl，检测波长：毛蕊异黄酮葡萄糖苷（260 nm，0～15 min），丹酚酸B（286 nm，15～30 min）。

2.1.2 混合对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B 对照品适量，加甲醇制成浓度分别为10.68、100.28 mg/ml 的混合溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 按处方比例，称取益气活血解毒合剂处方药材，加8 倍量水提取3 次，每次1 h，收集所得药液，浓缩至100 ml，即得益气活血解毒合剂样品溶液；精密吸取样品溶液200 μl，置于1.5 ml EP管中，加入400 μl 甲醇，混合均匀，25℃14 000 r/min离心10 min，离心半径为13.5 cm，取上清液作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液制备 按益气活血解毒合剂的处方，分别称取缺黄芪、丹参的其他药材，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 专属性考察 精密吸取上述3 种溶液各10 μl，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，阴性对照溶液中无相应吸收峰，被测成分无干扰且峰形良好，结果见图1。

2.1.6 线性关系考察 取“2.1.2”项下的混合对照品溶液，加甲醇逐级稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B 回归方程分别为Y=34.31X+8.941（r=0.999 9）；Y=5.281X-4.971（r=0.999 9）。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.106 8～10.680 0 mg/ml、丹酚酸B 在1.00 28～100.280 0 mg/ml 内与峰面积线性关系良好。

2.1.7 精密度考察 取“2.1.2”项下的混合对照品溶液10 μl，连续进样6 次，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷RSD 为0.51%，丹酚酸B RSD 为0.79%，表明仪器具有良好的精密度。

2.1.8 稳定性实验 取“2.1.3”项下供试品溶液，分别于供试品制备后0、6、9、12、16、24 h 按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷RSD 为0.93%，丹酚酸B RSD 为1.57%，表明该样品在24 h 内稳定。

2.1.9 重复性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液，平行制备6 份，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷RSD 为0.58%，丹酚酸B RSD 为0.31%，表明该方法重复性良好。

2.1.10 加样回收实验 取已知含量的益气活血解毒合剂样品溶液5 ml，平行量取6 份，按照质量浓度比约为1∶1 分别精密加入适量对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备，“2.1.1”项下色谱条件进样测定，结果见表1。

表1 加样回收实验结果

2.2 正交试验

采用正交设计试验L9（34）,以煎煮时间（A）、煎煮次数（B）、加水量（C）为考察因素，精密量取9 个正交实验样品溶液各20 ml，移至干燥至恒重的蒸发皿中，称量后水浴蒸干，于105℃干燥3 h，取出置干燥器中冷却30 min，迅速称量。浸膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%；W 为浸膏重量，V 为定容体积，Wt 为饮片重量。对浸膏得率、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和丹酚酸B的含量进行综合评分，分别赋予权重0.2、0.4、0.4，计算公式如下：综合评分（%）=（浸膏得率/组内最高值×0.2+毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量/组内最高值×0.4+丹酚酸B 含量/组内最高值×0.4）×100%。根据表3 极差R 分析可知，对试验结果影响因素C＞A＞B。方差分析结果显示，因素A、B 无显著性影响，因素C 具有显著性影响，且C3＞C2＞C1。综合考虑生产成本、工时、能源消耗等因素，最终选择加10 倍量水提取3次，每次1 h，即A2B1C3为最优提取工艺。结果见表2～4。

表2 益气活血解毒合剂提取工艺正交试验因素水平

表3 L9（34）正交试验设计及结果

表4 方差分析结果

2.3 验证实验

按处方量称取饮片3 份，每份86 g，按最优工艺提取，测定收膏率及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B含量。结果见表5。

表5 提取工艺验证试验结果

3 讨论

益气活血解毒合剂的君药为黄芪，臣药为丹参，2020 年版《中华人民共和国药典》[9]规定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为黄芪的定量指标，丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 为丹参的定量指标。由于黄芪甲苷在紫外波长范围内无响应[10-15]；丹参酮ⅡA 具有脂溶性，对光敏感，长时间加热可能会转化分解[16-17]，故选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B 为评价指标，分别赋予40%的权重。中药方剂药味多成分复杂，其疗效是建立在多成分、多靶点的综合作用的基础上，单一成分的含量难以全面衡量中药质量[18-20]，为了更加全面的评价提取工艺，故将浸膏得率赋予20%的权重。

益气活血解毒合剂成分复杂，单一检测波长难以兼顾每个待测成分的最佳灵敏度，故最终采用多波长切换法[21-22]。本研究预实验考察了不同的流动相体系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）、磷酸比例（0.01%、0.05%、0.1%）、柱温（25℃、30℃、35℃）、流速（0.5、0.8、1.0 ml/min）对色谱峰的影响，最终确定流动相体系为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）、柱温为35℃、流速为1 ml/min。