参芪解郁方对产后抑郁大鼠炎症反应的抑制作用

李净娅 秋 超 张丽萍

浙江中医药大学附属第一医院 浙江省中医院神经内科，浙江杭州 310000

产后抑郁（postpartum Depression，PPD）是产褥期常见的精神疾患，严重危害产妇的身心健康，其发病机制目前仍不明确。参芪解郁方是治疗轻型PPD 的有效方剂[1]，前期研究证实其可改善PPD 模型大鼠的行为学表现[2]，作用机制涉及整体调节大鼠的下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴的激素分泌及其受体表达[3-4]。近几年研究发现，该方可保护PPD大鼠的免疫器官并可调节大鼠外周血T 细胞比例[5-7]。近期多项研究证实，炎症反应激活与抑郁症的发病密切相关[8-11]，课题组也发现参芪解郁方可下调PPD 大鼠体内的白细胞介素-1 和白细胞介素-6 水平[12]，但其抑炎机制不明确，研究还不够深入。

因此，本研究拟将研究靶点定位于大鼠前额叶小胶质细胞以进一步观察参芪解郁方对PPD 的炎症抑制作用，探索该方的抑炎机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD 雌性大鼠24 只，SPF 级，2 月龄，体重（200±10）g。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号为[SCXK（沪）2017-0005]，使用许可证号为[SYXK（浙）2020-0024]。实验中动物自由摄食饮水，自然光照，光照周期12 h（7∶00～19∶00），室温20～22℃，相对湿度为60%～70%，室内保持安静。动物实验符合浙江中医药大学动物伦理委员会要求，并通过杭州鹰旸生物医药研发中心实验动物伦理委员会批准（EYOUNG-20201117-12）。

1.2 主要仪器、试剂与药品

1.2.1 主要仪器 加热石蜡包埋系统（Leica，型号：G1150H）；正置荧光显微镜（Leica，型号：DM3000）；成像系统（日本尼康，型号：Nikon DS-U3）；酶标仪（MD，型号：C MaxPlus）。

1.2.2 主要试剂AIF1/IBA Antibody（维百奥生物科技有限公司，江苏，批号：DF7552）；山羊抗兔IgG Hand＆L（HRP）预吸附二抗（美国Abcam Co.，Ltd.，批号：ab97080）；大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0180R1）；大鼠皮质醇（Cortisol，Cor）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0574R1）。

1.2.3 药品 苯甲酸雌二醇注射液（批号：190504，规格：2 ml∶4 mg×10 支），黄体酮注射液（批号：190509，规格：1 ml∶50 mg×10 支），购自上海全宇生物科技动物药业有限公司；参芪解郁方（药物保密），饮片配方颗粒来源于华润三九有限公司，由浙江中医药大学第一附属医院最终加工制成该方药颗粒剂；盐酸帕罗西汀胶囊（北京福元医药股份有限公司，批号：22005122，规格：20 mg×20 片）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与处理24 只大鼠先适应性喂养1周后，以随机数字表法将其分为4 组（每组6只大鼠）：假手术组、PPD 模型组、参芪解郁方组和西药对照组。

1.3.2 模型建立 参照既往文献[2，6，7，13]采用激素模拟妊娠状态后突然停撤法建立PPD 大鼠模型。

摘除3 组大鼠（PPD 模型组、参芪解郁方组和西药对照组）双侧输卵管及卵巢，连续5 d 美兰染色的阴道涂片提示无动情周期表示去势手术成功。假手术组仅摘取卵巢周围少许脂肪组织，保留卵巢和输卵管完整。

对已摘除卵巢的3 组大鼠，连续16 d 每日皮下注射溶于0.1 ml 甘油的雌二醇注射液（2.5 μg）和0.1 ml黄体酮注射液（5 mg），后7 d 每日仅注射溶于0.1 ml甘油的雌二醇注射液50 μg，以模拟大鼠“妊娠”状态下的激素分泌水平，第24 天（即“产后”第2 天）停止激素注射。假手术组动物连续每日注射相同剂量的甘油（前16 d 0.2 ml，后7 d 0.1 ml）。行为学旷场实验（水平格数和站立次数）评分下降，提示模型制备成功。

1.3.3 药物干预 参芪解郁方组：对造模后的大鼠连续3 周灌胃给予溶于蒸馏水的参芪解郁方颗粒剂。其用量参照既往文献[2，6-7]，浓度1.25 g 生药/ml，灌胃剂量均为1 ml/100 g；西药对照组：对造模后大鼠连续3周灌胃给予溶于蒸馏水的经典抗抑郁药物——盐酸帕罗西汀。其用量参照既往文献[2，6-7]，浓度为0.25 mg/ml，灌胃剂量均为1 ml/100 g；假手术组及PPD 模型组大鼠则连续3 周灌胃给予2 ml 蒸馏水。

1.4 观察指标

1.4.1 行为学测试 对灌胃3 周后大鼠行旷场实验。场箱（80 cm×80 cm×40 cm）底面用黑线均匀划分为25块方格。每只动物测定1 次，5 min/次，记录大鼠水平格数（大鼠穿越过的格子数）及站立次数。

1.4.2 采用ELISA 检测大鼠前额叶TNF-α、皮质醇Cor 水平 药物干预3 周并行为学检测后，取大鼠左侧前额叶脑组织，每组6 只。将前额叶脑组织充分匀浆后提取脑组织蛋白后，根据ELISA 步骤说明检测TNF-α 和Cor 水平。

1.4.3 采用免疫组织化学染色法测定大鼠前额叶小胶质标志性抗体Iba1 取材后选取大鼠右侧背外侧前额叶，放入10%中性甲醛中固定24 h 后，经石蜡包埋切片、梯度二甲苯及梯度酒精脱蜡处理。经微波加热法抗原修复（0.1 mol/L，pH=6.0 的枸橼酸液修复液，微波炉100 火力3 min，50 火力7 min）后进行免疫杂交（一抗AIF1/Iba1 Antibody 1∶50，二抗工作液1∶50）后DAB 显色剂显色，再进行苏木精复染，脱水，透明并中性树胶封片。每组选取3 张额叶切片，每个切片200 倍高倍镜显微镜下随机选取2 个视野，每组6 个视野，采用Image Pro Plus 进行图像分析，测定阳性区域的平均光密度（aerosol optical depth，AOD）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠旷场实验情况比较

PPD 模型组水平格数和站立次数低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；参芪解郁方组大鼠水平格数和站立次数高于PPD 模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠旷场实验情况（±s）

注 与假手术组比较，aP＜0.05；与PPD 模型组比较，bP＜0.05。PPD：产后抑郁。

2.2 各组大鼠前额叶中TNF-α、Cor 及Iba1 的表达

PPD 模型组TNF-α、Cor 及Iba1 指标高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；参芪解郁方组的TNF-α、Cor 及Iba1 指标低于PPD 模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2～3、图1。

表2 各组大鼠前额叶中TNF-α 和Cor 的表达（pg/ml，±s）

表2 各组大鼠前额叶中TNF-α 和Cor 的表达（pg/ml，±s）

注 与假手术组比较，aP＜0.05；与PPD 模型组比较，bP＜0.05。PPD：产后抑郁；Cor：皮质醇；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。

表3 各组大鼠前额叶中Iba1 的表达（±s）

表3 各组大鼠前额叶中Iba1 的表达（±s）

注 与假手术组比较，aP＜0.05；与PPD 模型组比较，bP＜0.05。PPD：产后抑郁；AOD：阳性区域的平均光密度。

3 讨论

本研究结果提示，参芪解郁方能改善PPD 大鼠的行为学表现。参芪解郁方是在归脾汤的基础上加减而来，全方由黄芪、党参、当归、炒枣仁、山萸肉、郁金、陈皮、佛手等组成，诸药配伍共奏补益心脾，颐脑醒神之功，对于轻型产后抑郁有显著效果[1]。

本研究结果提示，参芪解郁方可抑制PPD 大鼠前额叶小胶质细胞的表达，降低炎症细胞因子及Cor 的水平。有研究显示，抑郁症患者前额叶存在结构受损及5-羟色胺、Cor 等脑源性神经影响因子改变[14-17]，从而引起注意、记忆及情绪控制和交接的失常[18-19]，前额叶损伤可引起抑郁[20]，通过针对前额叶的经颅磁刺激治疗可提高抑郁症患者情绪调节能力[21]。结合以往研究结果提示，前额叶小胶质细胞可能是参芪解郁方的抗抑郁作用位点。

另外，既往研究发现动物脑内小胶质细胞的活化伴随着白细胞介素-1β 水平的增加导致了其抑郁行为[22]，通过抑制炎症细胞因子来调节小胶质细胞的激活可以产生抗抑郁作用[23]。Cor 是一种为应对压力而产生的类固醇激素，有临床研究发现，日间Cor 节律紊乱及高炎症水平可能是抑郁症躯体症状产生的神经生物学基础[24]。还有实验研究显示，过量的Cor 激活了动物脑内的胶质细胞，增加了神经炎症[25]。

研究结果提示，参芪解郁方可能通过抑制产后抑郁大鼠前额叶的Cor 水平，抑制炎症反应及小胶质细胞增生产生抗抑郁作用。本研究仅为初步的探索性研究，下一步需要更为深入、多靶点、多层面的研究来探讨参芪解郁方对于产后抑郁的抑炎作用机制。