不同炮制方法对川乌毒性成分的影响及其质量评价

黄 琦 韩秉辰 陈丹丹 黄先菊 李 竣 陈 晓

1.中南民族大学药学院，湖北 武汉 430070；2.湖北药昇中药科技有限公司，湖北 枣阳 441200

川乌属于毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥根部[1]，主要分布在四川、湖北、云南和陕西等地。生物碱是川乌的主要毒性成分和活性物质，炮制后的川乌具有祛风除湿、温经止痛的功效，临床上主要用来治疗风湿痹证[2]。另外，川乌是大毒之品，川乌中生物碱会导致心脏毒性和神经毒性[3]，目前认为川乌中主要毒性成分为双酯型生物碱(新乌头碱、乌头碱、次乌头碱)，经过炮制加工后，毒性较大的双酯型生物碱水解为毒性为其1/2000～1/4000的单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)[3-7]。川乌炮制的方法有很多，历代记载的炮制方法有70多种[8]。现代川乌炮制工艺有水煮法，蒸法，微波法等[9-11]，也有采取川乌趁鲜切薄片后炮制的方法[12]。由于不同饮片加工企业炮制设备工艺存在差异，川乌饮片的质量难以进行控制。

此外，“口尝微有麻舌感”是药典中制川乌的评价方式之一，但针对川乌麻度分级国内外尚未建立感官评价标准，“麻”作为质量评价方式与炮制工艺中的技术指标难以在产品标准中明确规定及进行检验。

本实验通过对比常压煮制、常压蒸制、高压煮制、高压蒸制和切片后蒸煮法，探究不同的炮制方法中药典规定的生物碱含量变化；并参照和借鉴花椒麻度评价，结合斯科维尔指数法川乌毒效成分含量，综合川乌炮制过程中切片形貌颜色变化，建立了川乌麻度的感官评价分析，为优选川乌炮制减毒的方法提供参考，为中药感官评价分析标准提供思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪 Waters 2965：alliance；色谱柱ZORBAX Extend-C184.6 mm×150 mm 5-Micron：Agilent technologies；万分之一天平CP224C：奥豪斯仪器有限公司；十万分之一天平 AUW120D：岛津公司；电子天平JM20002：余姚纪铭称重校验设备有限公司；移液枪：Eppendorf；高压灭菌锅YXQ-50SII：北京东南仪诚实验设备有限公司；超声波清洗器 KQ-500E：昆山市超声仪器有限公司；高压锅、蒸煮锅、25L食品级不锈钢桶、C22-T2240多功能电磁炉：均购置广东美的生活电器制造有限公司。

1.2 材料 川乌药材由湖北药昇中药科技有限公司提供，并经中南民族大学刘新桥副教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根。色谱纯乙腈：SIGMA-ALDRICH；冰醋酸，三乙胺，盐酸，分析纯甲醇均购置于国药集团化学试剂有限公司。纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。乌头碱(aconitioe，HPLC≥98%，批号：DST200729-006，乐美天医药德思物生物公司)；次乌头碱(hypaconitine，HPLC≥98%，批号：20170324，宝鸡市辰光生物科技有限公司)；新乌头碱(mesacontine，HPLC≥98%，批号：Y12A7H19379，上海源叶生物科技有限公司)；苯甲酰乌头原碱(benzoylacontine，HPLC≥98%，批号：P16A7F19499，上海源叶生物科技有限公司)；苯甲酰新乌头原碱(benzoylmesaconitine，HPLC≥98%，批号：20170329，宝鸡市辰光生物科技有限公司)；苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypalonitine，HPLC≥98%，批号：20170129，宝鸡市辰光生物科技有限公司)。

2 炮制工艺

2.1 浸泡 取原药材8000 g，除去杂质，备用。从中取50 g留样用于生川乌供试品制备。剩余生品在室温(25 ℃)下于25 L食品级不锈钢桶中用纯净水浸泡，液面高于药材5 cm，每隔6 h取较大个切开，以内无干心为浸泡终点。随机取50 g左右浸泡好的川乌在通风橱晾干，留样用于浸泡后川乌供试品制备。

2.2 炮制 取浸泡好的川乌分6组，每组取样(1000±10)g，保证每组大小均匀，分别命名为川乌常压蒸制组、川乌常压煮制组、川乌高压蒸制组、川乌高压煮制组，剩余2组川乌通风橱风干至6成干切片后命名为川乌切片蒸制组、川乌切片煮制组。

2.2.1 常压蒸制和切片蒸制 将川乌常压蒸制组，放入蒸煮锅的蒸笼中，开水蒸制。分别在蒸制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样切片观察外观性状，内无白心为炮制终点，通风橱干燥，备用。川乌切片蒸制组同法操作。

2.2.2 高压蒸制 将川乌高压蒸制组，高压灭菌锅中分别蒸制0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h时取样切片观察外观性状，以内无白心为炮制终点，通风橱干燥，备用。

2.2.3 常压煮制和切片煮制 将川乌常压煮制组，加10倍量清水，开水煮制，分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样切片观察外观性状，以内无白心为炮制终点，通风橱下干燥，备用。川乌切片煮制组同法操作。

2.2.4 高压煮制 将川乌高压煮制组放入高压锅中，加10倍水，高压煮制，分别在煮制0.5 h、1 h、1.5 h、2 h时取样切片观察外观性状，内无白心为炮制终点，通风橱干燥，备用。

3 方法

3.1 HPLC法

3.1.1 色谱条件 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调节pH值至6.20)为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235 nm[1]。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于2000。

表1 HPLC梯度洗脱程序

3.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称定对照品，用0.01%盐酸甲醇溶液定容到10 mL，制成每1 mL含新乌头碱、次乌头碱和乌头碱各0.6 mg的混合对照溶液。单酯型生物碱对照品同法操作(每1 mL含苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱各 0.6 mg)。取上述溶液各1 mL，分别置2 mL、5 mL、10 mL、25 mL量瓶中，加 0.01%盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。

3.1.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述对照品混合溶液10 μL，按照上述色谱条件，以对照品混合溶液中生物碱的浓度为横坐标，相应色谱峰的峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。见表2。

表2 六种生物碱标准曲线

3.1.4 供试品溶液制备 取药材粉末(过三号筛)约 2 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液 50 mL，称定重量，超声处理(功率 300 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣加 0.01%盐酸甲醇溶液使溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取注入液相色谱仪，测定，按标准曲线计算，即得。

3.1.5 精密度试验 取同一批川乌的供试品10 μL，按上述色谱条件重复进样5次，结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱峰面积的RSD分别为0.37%、0.64%、0.49%、0.97%、1.57%、1.32%。

3.1.6 稳定性试验 取供试品1份，按“3.1.4”项操作，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h进样，结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱的RSD分别为1.17%、1.39%、1.84%、1.38%、0.89%、1.74%。

3.1.7 重复性试验及加样回收试验 取川乌样品5份，按“3.1.4”项操作制备供试品，在“3.1.1”色谱条件下进行测定，重复性试验结果为乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱的平均含量分别为0%、0.011%、0.027%、0.003%，0.015%、0.03%；RSD分别为0.23%、0.42%、0.36%、0.34%、0.51%、0.35%。

取样品(生川乌)约1 g，共六份，精密称定，分别加入乌头碱(0.21 mg/mL)、次乌头碱(0.42 mg/mL)、新乌头碱(0.43 mg/mL)、苯甲酰乌头原碱(0.57 mg/mL)、苯甲酰次乌头原碱(0.41 mg/mL)和苯甲酰新乌头原碱(0.56 mg/mL)对照品溶液适量，按“3.1.4”项操作，在“3.1.1”色谱条件下进行测定，加样回收试验结果见表3。

表3 加样回收试验结果 (n=6)

3.2 川乌斯科维尔指数法麻度评价 取川乌不同炮制时间的炮制品切开观察，以药典规定内无白心，口尝有麻舌感为标准评价川乌炮制。麻舌感借鉴GB/T 38495-2020 花椒麻度评价[13]和GB/T 21265-2007辣椒辣度[14]的感官评价方法中斯科维尔指数法，结合文献[15]进行改进。用食用乙醇提取被检验样品中引起麻感的物质，将该提取液按比例稀释成不同浓度的醇水溶液，通过对比检验确定出评价小组恰好识别出有麻感时被检样液对应的最大稀释倍数，得到斯科维尔指数，确定麻度等级。

3.2.1 斯科维尔指数(Scoville index；Scoville pungency units；SPU)[16]在本标准测试条件下，被评价小组恰好识别出有麻感时被验样液的稀释倍数，可按式(1)计算。

(1)

式中：V1为样品提取液的移取体积，单位mL；V2为恰好识别出有麻感的样液移取体积，单位mL。

3.2.2 样品提取液制备 取炮制品粉末0.1 g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，加入乙醇50 mL，称定重量，20 ℃恒温超声提取20 min，放冷，用乙醇补足减轻的重量，将混合溶液全部转移至离心管中，2000 r/min转速下离心5 min，将上清液转移至容量瓶中。重复洗涤沉淀1次，洗涤所得上清液转移至同一容量瓶中，乙醇定容至200 mL，摇匀备用。

参考GB/T 38495-2020 花椒麻度评价，评价小组(10人)初步确定样品所属的可能麻感区段在A1～D3区间。根据表4中A～J麻感区段对应的取样量，移取相应体积(V1)的样品提取液置于100 mL棕色容量瓶中，纯净水稀释定容，制备成样液，用于下一步确定最小样液量。

表4 不同麻感区段对应的样品提取液稀释方法

3.2.3 样品最小样液量的确定 将制备好的样品提取液按GB/T 38495-2020不同麻感区对应移取体积，移取相应体积的供试品置于50 mL棕色容量瓶中，纯净水稀释定容。从移取体积由小到大由感官评价小组品评，直到识别出有麻感时的样液移取体积为最小样液量。当最大体积仍无麻感时，采用低一级麻味区段重复上述方法。

3.2.4 空白液制备 移取与被检供试品等体积的乙醇至50 mL容量瓶内，加纯净水定容，备用。

3.2.5 评价方法 根据GB 12310-2012，评价小组分别对供试品的最小样液量及空白液进行比对，评价结果为多次检验正确答案数的总和，根据二项式分布显著性检验表，在置信度大于95%推出存在感官差别所需的最少正确答案数，按公式1计算SPU。SPU与麻度等级换算按表5换算。

表5 SPU与麻度等级换算关系

4 结果

4.1 含量测定结果 图1、图2、图3为各生物碱和生川乌中色谱图，各峰无干扰。根据表6、图4可知，常压煮制、常压蒸制、高压煮制、高压蒸制4种炮制方法，双酯型生物碱含量都在炮制1 h内迅速降至药典规定值0.04%以下，后期在最低值处平稳。

①：苯甲酰新乌头原碱；②：苯甲酰乌头原碱；③：苯甲酰次乌头原碱

④：新乌头碱；⑤：乌头碱；⑥：次乌头碱

图3 生川乌 HPLC色谱图

A1：不同方法炮制的川乌中三种单酯型生物碱总含量变化图；A2：不同方法炮制的川乌中三种双酯型生物碱总含量变化图；B1：不同方法炮制的川乌中乌头碱含量变化图；B2：不同方法炮制的川乌中次乌头碱含量变化图；B3：不同方法炮制的川乌中新乌头碱含量变化图；C1：不同方法炮制的川乌中苯甲酰乌头原碱含量变化图；C2：不同方法炮制的川乌中苯甲酰次乌头原碱含量变化图；C3：不同方法炮制的川乌中苯甲酰新乌头原碱含量变化图。

表6 不同样品中浸泡24 h后各生物碱含量统计表 (n=3)

6种川乌炮制方法达到峰值的时间不同，常压蒸制，单酯型生物碱在炮制5～6 h内符合药典规定值范围0.07%～0.15%，5 h时达到峰值0.0779%，炮制7 h下降到规定最低值以下。高压蒸制川乌在0.5～2.5 h单酯型生物碱内全部可以达到药典要求范围0.07%～0.15%，并在炮制1 h时含量达最高0.1355%。川乌高压煮制单酯型生物碱在1～2 h达到药典标准范围0.07%～0.15%，1 h时达到峰值0.1319%，2.5 h以后降到药典规定值以下。川乌常压煮制单酯生物碱2～3 h达到药典标准，在2 h达到峰值0.1338%，3 h降到药典规定值以下。川乌切片煮制、切片蒸制单酯型生物碱含量均未达到药典标准范围0.07%～0.15%，可能与单酯型生物碱过度水解有关。取每种方法单酯型生物碱达到峰值的时间为较优工艺，每种方法炮制较优工艺如表7所示。

表7 不同炮制方法的最佳炮制工艺 (n=3)

4.2 炮制过程的形貌及感官评价 因使用HPLC进行对川乌炮制的过程进行质量检测的难度大，无法精准把控炮制达标时间和达标点，根据中国药典2020版描述，炮制需要达到内无白心口尝微有麻舌感，课题组对不同炮制方法和不同炮制时间的川乌切片进行观察，结果如图5所示。川乌炮制过程中白心逐渐变黄，当炮制时间继续增加时，药材切片的心由黄变暗黄色，最后接近黑色。

①：苯甲酰新乌头原碱；②：苯甲酰乌头原碱；③：苯甲酰次乌头原碱；④：新乌头碱；⑤：乌头碱；⑥：次乌头碱。川乌煮制色谱图中从1～8分别为生川乌、煮制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h。川乌蒸制色谱图中从1～8分别为蒸制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h。川乌高压煮制色谱图中从1～6分别为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h。川乌高压蒸制色谱图中从1～5分别为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h。

由评价小组对炮制的川乌进行了感观评价，结果见表8，麻度随着炮制时间的增加而减少，结合含量测定结果可以看到麻度等级1对应的炮制品都达到药典规定标准。证明斯科维尔指数可以应用在川乌炮制品的感官评价上，运用斯科维尔指数法实现“麻舌感”感官评价的定量，麻度等级为1时为炮制终点。

表8 川乌炮制品麻度等级表

5 讨论

在标品的检测中，多数研究采用单、双酯型生物碱混合检测的方法，但在实验过程中发现双酯型生物碱标品存在分解现象，为保证标品结果的精确性，故将单、双酯型生物碱标品分开进行检测。

4种炮制方法单酯生物碱峰值差异不大，主要差异在炮制时间长短；煮制的方法较蒸制达到单酯型生物碱转化最大值时间明显减少，分析原因是煮制药材暴露在水中会使水解反应更加完全；高压的方法较常压的方法炮制时间也明显缩短，表明在高温高压的条件下会加快水解反应速率。

综上所述，川乌在6种炮制方法中都可以在1h内使双酯型生物碱降至0.04%以下，单酯型生物碱呈增加后下降的趋势，符合生物碱水解规律，双酯型生物碱水解生成单酯型生物碱，此时双酯型生物碱含量下降，单酯型生物碱含量升高，继续加热后单酯型生物碱进一步水解生成醇胺型生物碱，单酯型生物碱含量因此下降。所以需要合适的炮制时间，时间过短，单、双酯型生物碱不符合药典要求，时间过长造成单酯型生物碱继续变化。本研究中川乌炮制单酯生物碱含量最大值均在药典规定范围，故建议炮制达到单酯生物碱含量最大值时作为最佳炮制时间。结合实际生产工艺现实(设备、成本、环保)，为达到省时省工的目的，通过实验表明常压煮制的炮制工艺较其它几种方法对设备需求低，炮制时间合适，是符合工业生产较佳方法。再与含量测定结果对比，结果显示生川乌在常温浸泡24 h，常压煮制2 h为较佳生产工艺。

通过观察不同炮制时间的药材切片颜色和麻度评价，与含量测定结果进行比对，发现川乌炮制过程中颜色的变化和单酯型生物碱的生成存在相关性，川乌随炮制时间的增加，白心逐渐变黄，此时单酯型生物碱呈现上升趋势，当炮制时间继续增加时，药材切片的心由黄变暗黄色，此时生物碱呈现平稳下降趋势，且蒸制法炮制暗黄色会加深，甚至接近黑色，此时单酯型生物碱急剧下降。可以观察到药材的中心为暗黄色时最佳，比对含量测定结果，均达到药典标准。所以可以用切片颜色来判断炮制终点，切开药材，内心为暗黄色可作为炮制终点。结合斯科维尔指数，麻度强度为1时，可以视为炮制终点。川乌无法炮制与HPLC检测同时进行，在炮制过程中含量检测前，麻度评价与药材切片颜色这两项因素可以作为质量评价的参考，判定炮制终点。最后结合含量测定，对川乌质量评价做出明确判断。

本研究为制川乌的规范化生产提供了选择和参考，通过观察川乌炮制过程中切片颜色，实现了川乌炮制过程中质量评价和技术指标的快速评判，并首次将斯科维尔指数应用于川乌麻度评价，为川乌麻度评价的量化提供了参考，以及给炮制后川乌的质量和临床用药安全提供一定的理论依据。