MTT法在中草药成分干预细胞增殖及活性中的应用*

任周新

河南中医药大学中医药科学院/呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心,河南 郑州 450046

MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]法是一种检测细胞增殖和活性的方法,在中草药活性成分的体外筛选中应用广泛。MTT法的检测原理为:在细胞培养环境中加入MTT,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH) 还原MTT,形成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒,而死细胞无此功能;加入二甲基亚砜溶解甲瓒,检测吸光度值,以该值反映样品活细胞数量[1-2]。灵敏度高、操作简单和经济性好的优点是这种方法得以广泛应用的原因,但这种方法也有一定的局限,如不能用于某些活性药物分子的检测[3-8]。本文就MTT法在中草药活性成分的应用和局限进行概括和总结。

1 常用的MTT方法

体外培养的细胞,按照是否能贴附于支持物上生长的性质,分为悬浮型和贴壁型两大类。这两类细胞的MTT操作步骤存在差异。

贴壁细胞:向细胞培养液中加入MTT溶液,继续培养一段时间。然后终止培养,加入二甲基亚砜溶液,震荡溶解甲臜,最后检测液体的吸光度。需要注意的是,某些测试的中药化合物分子,本身带有颜色,需要清除这种干扰。可以在加入MTT前,吸弃含药培养液,用PBS或单纯培养液冲洗细胞2～3遍,再加入MTT液。悬浮细胞:在培养液中加入MTT溶液,培养一定时间后,离心,除去上清,加入二甲基亚砜,最后检测吸光度。WST-8[2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt]是一种水溶性四唑盐,为MTT的优化产品。它的主要特点是在线粒体内的脱氢酶反应下,还原生成水溶性的甲瓒,因此,可以直接检测液体的吸光度。尽管WST-8操作更为简单,但存在不能排除药物分子颜色干扰的不足。

2 波长的选择

MTT方法通过检测甲瓒的吸光度值间接反映细胞的活性或活细胞数量,检测波长的确定是关键环节,文献报道的检测波长存在一定波动。在中国知网的高级检索中,选择:摘要检索,输入MTT;文献来源,输入中草药。查询《中草药》杂志1999—2022年发表的应用MTT法评估中药活性分子影响细胞增殖或活性的研究论文。找到509篇详细描述MTT方法的论文,选择490 nm检测波长的有209篇,选择570 nm检测波长的有197篇,选择492 nm检测波长的有33篇,选择540 nm检测波长的有6篇,选择550 nm或590 nm检测波长的各有4篇,选择595 nm或450 nm的各有3篇,选择630 nm的有2篇,选择510 nm、500 nm或493 nm的各有1篇,合计464篇选择单波长检测;26篇选择了检测波长为570 nm/参比波长630 nm,5篇选择了检测波长为570 nm/参比波长620 nm,4篇选择了检测波长为570 nm/参比波长450 nm,检测波长为570 nm/参比波长490 nm、检测波长为490 nm/参比波长650 nm、检测波长为595 nm/参比波长630 nm、检测波长为570 nm/参比波长655 nm各有1篇,6篇未明确检测波长和参比波长,合计45篇选择了双波长检测。上述报告中,检测波长范围为450 nm到630 nm;单波长检测应用较多,达到91.2%,双波长检测为8.8%;单波长检测中,490 nm和570 nm应用最多,分别达到45.0%和42.5%。

检测波长的差异反映了不同的中草药活性分子或培养液等对MTT法吸收光谱的影响。甲臜的吸收高峰在550～600 nm,这也是较多研究选择 570 nm 作为检测波长的依据。但甲臜的吸收光谱受到多种因素的影响,溶液的酸碱度或某些分子(残存的培养基分子、细胞残存的分子以及残留的药物分子等)都可能改变甲臜的吸收光谱。应预先采用全波长扫描,在550 nm的一定波长范围内,确定最大吸收峰波长,作为检测波长[9-13]。如果缺乏全波长扫描设备,则预先分别采用490 nm或 570 nm 检测,选择吸光度值高的波长作为检测波长。

单波长检测受到样本浊度、干扰色和电路(包括噪音、漂移、电压等)等因素的干扰,因此,设定另一个参比波长,能够减少测定干扰和电路干扰,从而减小了结果的变异系数CV值,提高结果的精确度。但多数情况下,参比波长检测的光密度OD值较小,不影响对结果的分析和判断;另外,双波长检测酶标仪价格昂贵,普及率不高,这些可能是单波长检测选择较多的原因。尽管如此,双波长检测更为灵敏和准确,应当优先选择应用。

3 对照选择和结果分析

MTT法经常采用的对照有两种模式:一种是两孔设置,样本孔加入含有药物的培养液,对照孔加入单纯的培养液;另一种是三孔设置,除了上述两孔外,还有一个空白孔,该孔没有细胞,仅加入培养液。

两种模式的结果计算如下:两孔设置的单波长检测按照细胞存活率=A药物/A对照,判断细胞活力[14-18];三孔设置的单波长检测按照细胞存活率=(A药物-A空白)/(A对照-A空白),判断细胞活力[19-23]。双波长检测按照细胞存活率= (A检测波长-A参比波长) 实验组/(A检测波长-A参比波长) 对照组,判断细胞活力[24-28]。上述公式中,A指检测的OD值。

除了应用上述公式判断细胞活力外,还可以用增殖率、抑制率或细胞增殖抑制率等分析药物的影响[29-33]。如采用细胞增殖抑制率=1-A给药/A对照[34-38]或抑制率=1-(A给药-A空白)/(A对照-A空白)[39-41]。还有一些报告,以半数抑制浓度(inhibitory concentration of 50%,IC50)判断药物对细胞增殖的影响[42-48]。

三孔设计考虑到了培养液对结果的影响,分析结果更为准确,但增加了工作量和培养液的消耗,降低了筛选效率。在实际应用中,大量有效成分筛选可选择两孔设计,而准确性要求高的实验则可选择三孔设计。在结果的计算分析中,IC50作为判断药物对细胞增殖、细胞毒性及细胞活力的指标,结果更为严谨和可靠。

4 检测方法的质量控制

需要注意的是,某些化合物可能与MTT直接发生化学反应产生假阳性结果,如橙皮苷、木犀草素和槲皮素可直接与MTT反应,OD值随着浓度的增加而增加[49-51]。增加药物培养时间或降低药物浓度能够减少假阳性率[52]。另外,在加入MTT前,用培养液或PBS冲洗贴壁细胞,除去残存药物,是减少这种干扰的有效方法[11,53]。但有文献报道紫草素与甲臜的颜色相近,吸收峰部分重叠,在低浓度紫草素的干预下,MTT法所测得的 A 值会增加。在高浓度紫草素作用下,几乎没有活细胞,但仍能检测到较高的OD值,这种假阳性是进入细胞的紫草素而非甲臜的结果[54]。显然,采用加入MTT前清洗细胞的方法无法清除细胞内残存药物的影响,这就需要用其他方法取代MTT法进行相关检测。另外,MTT法应用于增殖检测的基本条件之一,是假设各实验组的单个细胞SDH酶活性大致相同。某些药物通过应激、抑制剂非靶效应的细胞适应性代谢及线粒体重编程可明显改变细胞SDH活性[55],影响检验结果,甚至得出与事实相反的结论[5]。这种现象也降低了MTT结果的可靠性。

为了防止上述现象导致MTT检测结果的失真,需要采取一定的质量控制方法。例如,应用MTT之前观察细胞,记录细胞的数量或密度(定性或定量),与MTT的结果对照。如果记录显示加药的细胞密度或数量明显减少,MTT结果为增殖,那么否定MTT的结果。另外,可采用直接细胞计数、3H-TdR法等方法判断细胞增殖,采用3H-TdR 法、台盼蓝染色法或5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)法等判断细胞活力[49,56-62]。

5 结语

目前,MTT法已经成为评估中草药活性成分影响细胞增殖、毒性或活性的重要方法。但由于中草药分子量较大、结构复杂,存在某些基团与MTT分子基团相互作用,导致最高吸收峰漂移,此外,某些分子可进入细胞,而这些分子的吸收峰与甲臜相似。这些情况可能造成检测结果的失真,甚至产生错误的结论。清洗贴壁细胞等质控方法有时不能解决上述问题,因此,联合应用BrdU、3H-TdR 法、直接细胞计数或台盼蓝染色法是确保研究结果可靠的方法。但比色方法BrdU仍然存在化合物分子引起的吸收峰漂移等问题,3H-TdR 法、直接细胞计数或台盼蓝染色法没有上述问题,但3H-TdR 法有放射性污染的缺点;直接细胞计数不能用于细胞活力的评估,对于贴壁细胞,需要引入消化细胞的步骤,会不可避免地破坏某些细胞,也可能导致结果失真;台盼蓝染色和细胞计数还存在操作烦琐、效率低下、灵敏度低等缺点。因此,应该根据检测的实际情况,选择上述方法与MTT法联合应用,综合分析结果(图1),以快速、准确、客观地反映药物干预效应。

图1 MTT法与其他方法联合应用评估活性成分干预细胞的增殖