基于主成分分析及隶属函数法对芝麻苗期耐热性综合评价

苏小雨 高桐梅 张鹏钰 李丰吴寅 王东勇 田媛 卫双玲

（1 河南省农业科学院芝麻研究中心，450002，河南郑州；2 神农种业实验室，450002，河南郑州；3 河南省特色油料作物基因组学重点实验室，450002，河南郑州）

作物的产量及品质受环境和遗传双重因素制约，其中，高温是一种常见的重要环境因子。近年来，随着温室气体排放和气候变暖，全球范围内高温灾害频繁发生，且范围也越来越广，已对作物的正常生产构成严重威胁[1-2]。芝麻（Sesamum indicumL.）作为我国重要的特色油料作物，栽培历史悠久，种植范围广[3]。高温热害是我国芝麻生产上经常遇到的气象灾害。芝麻主产区夏季气温普遍较高，高温天气频繁发生导致落花严重，生长发育受到影响，显著降低了芝麻产量和品质。此外，世界各地对芝麻产品的需求不断上升，种植面积不断扩大，全球芝麻种植面积从2007 年的710 万hm2增加到2019 年的1313 万hm2[4]，非传统地区芝麻的种植面积也在增加，研究芝麻对高温的响应不仅能确定其适宜产区，还可以应对与气候变化相关的挑战[5]。因此，如何提高芝麻耐热性和选育耐热性品种是目前急需解决的问题。

高效评价鉴定方法是选育耐热性品种工作顺利开展的基础，然而作物的耐热性是一种复杂的生物学现象，不同或同种作物的不同基因型和不同生育期耐热性受高温强度、持续时间及与其他逆境复合因素的影响不同[6]。目前，作物苗期耐热性主要通过测定高温处理后存活天数、相关形态指标及生理生化指标等，利用主成分分析和隶属函数法来综合评价，该方法已广泛应用于多种作物，如玉米[7]、大豆[8]和小麦[9]等。研究[10-13]表明，高温胁迫下膜的热稳定性、光合相关指标以及抗氧化酶活性是公认的耐热性鉴定生理指标，但在不同作物耐热性评价中，这些指标的变化存在明显差异，在不同作物中起关键作用的指标也明显不同。综上所述，不同作物的耐热性评价具有特异性，不同作物在不同的高温环境下，其评价方法和标准仍需进一步探索和构建。

目前，有关芝麻耐热性鉴定方法的研究鲜见报道，为了探究不同芝麻品种的耐热性，建立芝麻耐热性鉴定体系和评价标准以及明确芝麻耐热性与其内部生理过程变化的关系，本研究从芝麻种质资源材料库中筛选出20 个芝麻品种为试验材料，经高温处理后通过测定相关耐热性指标，进行相关性和主成分分析，构建芝麻耐热性评价体系，为耐热性芝麻新品种的选育和相关高产栽培提供种质资源及理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取来源和种皮颜色不同的20 份芝麻种质资源为试验材料，材料均由河南省农业科学院芝麻研究中心提供，具体信息详见表1。

表1 供试芝麻种质资源信息Table 1 Informations of tested sesame germplasm resources

1.2 试验设计

试验于河南省农业科学院芝麻研究中心实验室进行，采用盆栽试验，在20 份芝麻材料中选取籽粒饱满、大小均匀的种子播种在塑料盆（直径16cm，高14cm）中，每个品种重复3 盆。培养基质中营养土:珍珠岩为3:1，在光照培养箱中育苗，培养条件为光照14h/黑暗10h，湿度70%，光照350μmol/(m2·s)，温度30℃。待植株长至3 对真叶时选取长势一致的植株进行高温处理，选取43℃±1℃作为高温胁迫处理，以30℃±1℃条件下正常生长的幼苗为对照，连续处理直到植株死亡，记录每天植株死亡数，每个处理重复3 次。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 株高和叶片干重 高温胁迫处理8d 后，测定每个芝麻基因型的高温和正常环境下的植株株高，采集叶片后放入烘箱中105℃杀青15min，再在80℃烘至恒重后测定干重[14]。

1.3.2 相对电导率 高温胁迫处理8d 后，采用电解质渗漏法测定相对电导率，方法如下，检测高温胁迫处理与对照植株第3 对真叶，用蒸馏水冲洗3 次，滤纸吸干叶片表面水分后，置于50mL试管中，加入去离子水10mL，室温下浸泡12h，用便携式电导率仪（DDBJ-350，上海仪电科学仪器股份有限公司）测定溶液电导率（R1），然后加热煮沸30min，冷却至室温后，再次测定溶液电导率（R2），相对电导率（REC，%）=R1/R2×100。

1.3.3 存活天数 在高温胁迫下，记录每天不同品种植株死亡个数，利用加权平均值法计算存活天数，存活天数（SV）=∑（胁迫天数×每天死亡株数）/总株数。

1.3.4 叶绿素含量（Chl） 利用叶绿素仪（SPAD-502 Plus，Konica Minolta）测定高温胁迫处理8d和对照植株第3 对真叶叶绿素相对含量（SPAD值）。

1.3.5 气体交换参数和叶绿素荧光参数 采用GFS-3000 光合作用测定仪（WALZ，德国）在9:00-10:30 测定基部第3 对真叶净光合速率（Pn），有效辐射强度为1500mol/(m2·s)。利用双通道调制叶绿素荧光仪Dual-PAM-100（WALZ，德国）测定叶片叶绿素荧光参数。用叶片夹夹住叶片，暗适应30min 后测定初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、最小荧光（Fo′）及稳态荧光（Fs）等荧光参数，计算实际量子产量（φPSⅡ）和光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学率（Fv/Fm）。

1.3.6 生理生化指标 称取不同基因型品种高温和正常环境下处理的叶片样品0.2g，加入预冷的磷酸缓冲液3mL（50mmol/L，pH=7.8）在研钵中磨成匀浆，吸入离心管中在4℃环境下12000g 离心20min，将上清液定容到10mL，每个处理重复3 次。上清液用于测定丙二醛（MDA）、游离脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性[15-17]。采用氮蓝四唑法测定SOD 活性，SOD 的反应液为依次加入pH 7.8 的PBS 缓冲液、甲硫氨酸、NBT（氮蓝四唑）、EDTA（乙二胺四乙酸）、核黄素液及酶液。用加入缓冲液作对照管，以加粗酶液为测定管，放置在光照下约20min，以黑暗对照管调零，在560nm 比色测定光吸收值。

SOD 总活性（U/g）=（Ack–Ae）V/（Ack×0.5×W×Vt），式中，Ack为对照管的吸光度，Ae为样品管的吸光度，V（mL）为提取液总量，Vt（mL）为测定用提取液量，W（g）为样品鲜重。

采用愈创木酚法测定POD 活性，酶反应体系为30μL 酶液加入3mL 反应液，反应液为50mL PBS，加入愈创木酚（2-甲氧基酚）28µL，搅拌溶解后加入30%H2O219µL。POD 活性计算以每分钟OD 值变化（升高）0.01 为1 个酶活性单位（U）。POD 活性[U/(g·min)]=ΔA470×Vt/（W×Vs×0.01×t），式中，ΔA470为反应时间内吸光度的变化，W（g）为叶片的质量，t（min）为反应时间，Vt（mL）为提取液总量，Vs（mL）为测定用提取液量。

采用紫外分光光度法测定CAT 活性；采用硫代巴比妥酸法测定MDA 含量[18]；采用磺基水杨酸法测定Pro 含量[18]；采用试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）测定H2O2含量和超氧阴离子产生速率。

1.4 数据处理

采用Excel 整理数据，采用DPS v18.10 进行相关性分析、主成分分析、隶属函数分析、聚类分析、灰色关联度及逐步回归分析。

耐热系数（γ）=高温处理测定值/对照处理测定值。根据提取的特征值，以大于1 或累计贡献率大于80%的准则提取主成分。利用隶属函数将每个主成分上各品种的性状综合指标的得分值进行标准化，μ（xi）=(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)，i=1，2，3，…，n。，式中，wp表示提取的第p个主成分的权重，λp表示提取的主成分所对应的贡献率。，式中，C表示高温处理响应因子综合值，以C值进行聚类统计，划分耐高温等级。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下芝麻相关指标遗传变异分析

由表2 可知，高温胁迫后各芝麻品种的株高、干重、叶绿素含量、Pn和Fv/Fm较对照均下降（γ＜1），而REC、MDA 含量，SOD、POD、CAT活性、产生速率和H2O2含量均升高（γ＞1），仅Pro 含量存在降低和升高（γ＞1 或γ＜1）。同时发现，除株高外，同一指标耐热系数在各品种间存在差异，且各指标变异系数差异明显，其中Pn变异系数最大，其次为Pro、H2O2含量和存活天数，株高的变异系数最小，整体为3.53%～18.26%。由于不同指标的耐热系数在品种间的变异幅度较大，根据单一性状指标的耐热系数直接判断芝麻品种的耐热性过于片面，缺乏可靠性，因此，需进一步对各指标相关性进行分析和评价。

表2 芝麻种质资源单项指标耐热系数和存活天数Table 2 Heat-tolerance coefficien of each single indext and survival days of sesame germplasms

2.2 高温胁迫下各指标间相关性分析

由相关系数矩阵（表3）可知，各指标间存在不同程度的相关性，X1（SV）与X3（DW）、X6（Pn）、X8（Fv/Fm）和X9（Pro）呈极显著高度正相关（R＞0.8，P＜0.01），相关系数分别为0.83、0.84、0.82 和0.92；与X5（SPAD）、X10（SOD）、X11（POD）和X12（CAT）呈极显著中度正相关（0.5＜R＜0.8，P＜0.01），与X4（REC）、X7（MDA）、X13（）和X14（H2O2）呈极显著高度负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.86、-0.78、-0.73 和-0.88。此外，其他指标之间存在不同程度的相关性。由此看出，各指标间有着复杂的相关性，所反映的耐热性信息存在不同的交叉与重叠现象，充分说明芝麻耐热性为综合性状。因此，为了全面系统地评估各品种（系）的耐热性，需将各单项指标综合考虑从而得到较为准确的信息量，消除单一指标评价耐热性的不足，需要进一步采用多元分析方法进行综合评价。

表3 不同芝麻品种的耐高温系数和存活天数的相关性分析Table 3 Correlation analysis of the heat-tolerance coefficients and survival days in different sesame varieties

2.3 高温胁迫下不同芝麻品种指标的主成分分析

通过主成分分析法对不同芝麻品种测定的单项指标进行分析（表4），根据主成分因子累计贡献率大于80%的准则提取了3 个主因子，将14 个单项指标换算为3 个新的相互独立的综合指标，分别用CI(1)、CI(2)和CI(3)表示，其特征值分别为10.09、0.94 和0.66，贡献率分别为72.09%、6.74%和4.71%，累计贡献率达83.54%，包含芝麻耐热性的大部分信息，说明这3 个综合主因子具有较强的信息代表性。此外，通过各性状的成分矩阵分析，从各主成分综合指标系数大小可以看出，第1 主成分主要包括X1、X3、X4、X6和X14；第2主成分主要包括X2；第3 主成分主要包括X9、X10、X11和X12。结果表明，通过主成分分析取得的3个独立的综合性指标可以较为全面地反映出原始14 个指标包含的信息，能够准确地进行芝麻耐热性评价分析。

表4 各主成分综合指标的系数及贡献率Table 4 Coefficients and contribution of comprehensive indexes of principal components

2.4 不同芝麻品种耐热性综合评价

利用DPS v18.10 数据处理软件对各单项指标的耐热系数和存活天数进行标准化，标准化后的数据和通过主成分分析得到的各主成分综合指标的指标系数进行对应乘积，计算出每个芝麻品种的3 个综合指标得分值[CI(x)]（表5）。根据公式计算每个材料3 个主成分综合指标的隶属函数值μ(x)，然后计算各主成分综合指标的权重，3 个主成分综合指标的权重分别为0.86、0.08 和0.06，各材料的综合得分值（C）为各材料的耐热能力，C值越大，该品种的耐热性越高。由表5 可知，通过各品种C值排序，不同芝麻材料耐热性表现为SP117 ＞SP170 ＞SP002 ＞SP028 ＞SP133 ＞SP157＞SP162＞SP102＞SP146＞SP067＞SP018＞SP174 ＞SP112 ＞SP039 ＞SP014 ＞SP197 ＞SP019＞SP059＞SP078＞SP184。

表5 不同芝麻品种的综合指标值、隶属函数值μ(x)、权重和综合得分值（C）Table 5 Values of different sesame varieties’comprehensive index,μ(x),index weight(IW),and comprehensive index score value(C)

2.5 不同耐热性芝麻品种聚类分析

如图1 所示，在数据标准化后欧氏距离0.15处可将20 个芝麻品种分为6 个类群，类群Ⅰ为强耐热型（C≥0.86），包括SP117（河南，粒白）和SP170（河南，粒白）；类群Ⅱ为中耐热型（0.76≤C≤0.80），包括SP002 和SP028；类群Ⅲ为耐热型（0.56≤C≤0.70），包括SP067、SP102、SP133、SP157、SP146 和SP162；类群Ⅳ为敏感型（0.42≤C≤0.48），包括SP018、SP039、SP112 和SP174；类群Ⅴ为中敏感型（0.33≤C≤0.38），包括SP019、SP197 和SP014；类群Ⅵ为高敏感型（0.09≤C≤0.17），包括SP059、SP078 和SP184。在20 个芝麻品种中，耐热型品种多来源于河南和江西，共筛选出白粒品种5 个、黄粒品种2 个、黑粒品种3 个；敏感型品种多来源于山东，共筛选出白粒品种4 个、黄粒品种4个、黑粒品种2 个。

图1 20 个芝麻品种耐热性聚类树状图Fig.1 Dendrogram of thermotolerance for 20 sesame varieties

2.6 不同芝麻品种各单项指标与C 值的灰色关联度分析

由表6 可知，各单项指标中存活天数与C值关联最为密切，关联系数为0.69，其他指标关联性较大分别为叶片干重＞Pn＞SPAD＞Fv/Fm＞Pro，关联系数分别为0.64、0.62、0.59、0.58 和0.57。这6 项指标与耐热性关联系数较高，尤其是存活天数可能是芝麻耐热性品种评价的关键因素，可用于实际鉴定评价和等级划分工作的主要参考指标。

表6 不同芝麻品种各单项指标与C 值的灰色关联度分析Table 6 Analysis of grey correlation degree between each single index and C-value of different sesame varieties

2.7 芝麻耐热性评价指标的筛选

为了有效分析14 个单项指标与不同的芝麻品种耐热性的对应关系，通过多元逐步回归分析方法以C值为因变量，以各单项指标耐热系数和存活天数为自变量建立最优回归方程，预测耐热性数学模型，芝麻耐热性鉴定回归方程：

C=-1.50+0.024X1+1.49X2+0.27X3+0.25X6–0.16X7+0.04X10+0.07X11+0.18X12–0.14X14，该方程决定系数R2=0.998，F=2012.87，达到极显著性水平（P＜0.001），Durbin-Watson 统计量d=2.68，充分说明该模型的解释能力较强。从回归方程式中可知，14 个单项指标中有9 个指标与C值存在显著相关性（P＜0.05），分别为X1（SV）、X2（PH）、X3（DW）、X6（Pn）、X7（MDA）、X10（SOD）、X11（POD）、X12（CAT）和X14（H2O2），这9个指标可作为芝麻幼苗期耐热性评价鉴定指标。

3 讨论

高温胁迫是影响植物生长发育的主要环境因子之一，对作物生长过程中所有阶段均造成不同程度的损害，主要是造成植物细胞内稳态的不可逆转的破坏、生理过程紊乱、代谢途径的破坏、结构和功能蛋白质、代谢物和膜的降解，最终导致植物死亡[19-22]。研究[23-25]表明，高温导致植物的生长受到抑制和干重显著降低，主要是由于活性氧的过量积累导致膜脂过氧化程度加深，膜完整性丧失，叶绿素降解，光系统结构遭到破坏致使光合作用受到抑制。本研究发现，在20 份试验材料中，高温胁迫后各芝麻品种的株高、叶片干重、REC、叶绿素含量、Pn以及Fv/Fm均有不同程度下降，活性氧和MDA 含量均显著提高，表明高温胁迫能够抑制芝麻的生长发育，与活性氧的过量积累导致的膜脂过氧化和光合作用下降密切相关。此外，为有效解除高温胁迫导致过量活性氧的毒害作用，植物自身演化出一系列的抗氧化防御系统[26]，当植物感受到高温胁迫压力时通过提高这些酶的活性来增强自身的耐热性。本研究发现，高温胁迫后各芝麻品种的抗氧酶活性均提高，表明这些抗氧化酶在芝麻适应高温逆境和自我防御保护中扮演着重要角色；而Pro 含量在各品种中呈现升高或降低趋势，这可能是与不同芝麻品种的遗传背景复杂有关。

植物的耐热性是一种复杂性状，由于这些性状的遗传控制具有多基因性质特征，其受多基因位点调控[27]。综上可知，高温胁迫能够影响植物的多个数量性状指标，且各指标之间存在相关性，存在信息交叉和重叠现象，因此，用单一性状指标去衡量植物的耐热性过于片面，可靠性不足，如何准确评价植物的耐热性是选育耐高温品种的基础条件[28]。目前，对植物耐热性的评价方法主要采用多元统计分析方法，即利用主成分分析和隶属函数法将不同的测量指标转换成新的个数较少和相互独立的综合指标，能够反映出植物所有测量指标的大部分信息，计算出各材料间的耐热性综合指标值，从而准确评价各材料的耐热性。庞强强等[29]在高温胁迫下，利用主成分分析和隶属函数分析对20 个菜心品种进行耐热性评价，将21 个指标转化为3 个独立综合指标，将20 份材料划分为6 个耐热等级，并筛选出热害指数、POD活性、MDA、可溶性糖和H2O2等6 个指标作为关键综合鉴定指标；靳路真等[8]通过测定155 份大豆材料的13 项指标，利用主成分分析转换成6 个综合指标，通过综合得分值进行聚类分析，划分出6个耐热类型，筛选出百粒重、单株荚重、每荚粒数和蛋白质等7 个指标作为大豆开花期耐热性评价指标，单株粒重、单株荚重、地上部干物重和株高等7 个作为大豆豉粒期耐热性的评价指标；李敏等[30]对20 个小麦品种进行耐热性分析，利用主成分分析将9 个测定指标转化为3 个独立综合指标，利用隶属函数法将不同小麦品种耐热性划分3 个等级，并筛选出SOD 活性、单穗粒重、CAT活性和MDA 含量等7 个指标作为小麦灌浆后期耐热性的评价指标。这些结果充分说明，主成分分析和隶属函数分析用于评价植物的耐热性具有可靠性和高效性，同时也表明，同一时期不同的作物用于筛选耐热性的评价指标不尽相同。本研究采用主成分分析、隶属函数法、系统聚类和多元逐步回归分析等分析方法对芝麻幼苗期耐热性进行了综合评价，使得芝麻耐热性评价更加科学合理，可靠性强，避免了单一指标作为耐热性评价的局限性和片面性。

近年来，芝麻种植区高温频繁发生，严重影响芝麻的生长发育，然而，对于芝麻耐热性种质资源挖掘的研究较少。因此，对芝麻种质资源进行耐热性评价，为挖掘耐热性芝麻种质资源、选育耐热性芝麻新品种及解析耐热机理和遗传分析提供了核心材料。本研究通过用欧式距离法对芝麻品种的C值进行耐热性等级聚类分析，将20个品种划分为6 类等级，其中耐热型芝麻品种多源于河南，敏感型多分布于山东，表明芝麻耐热性与材料的地理来源存在一定的关联，可能是由于长期自然选择的原因，仍需进一步扩大种质资源进行筛选验证。本研究可为芝麻抗逆栽培、耐热品种选育和改良提供优良的亲本材料和科学依据。

4 结论

在高温胁迫下，对20 个芝麻品种苗期进行耐热性评价鉴定，将20 个品种划分为6 个等级，其中筛选出强耐热型品种2 个（SP117 和SP170）和高敏感型品种3 个（SP059、SP078 和SP184）；建立了芝麻苗期耐热性评价数学模型，筛选出9个关键评价指标，可以快速鉴定芝麻的耐热性，简化了鉴定程序，提高了鉴定效率。