马铃薯种质资源抗病毒分子标记辅助筛选

娄树宝 杨梦平 邢金月 翟玲侠 王辉 刘春生 王立春 宋继玲

（1 黑龙江省农业科学院克山分院/国家马铃薯种质资源试管苗库（克山），161005，黑龙江齐齐哈尔；2 青海大学农林科学院，810016，青海西宁）

马铃薯是世界第三大粮食作物，种植面积仅次于小麦和水稻[1]。目前，全球有160 多个国家和地区种植马铃薯，中国的马铃薯种植面积和总产量均居世界首位，但单产没有达到世界平均水平[2]。马铃薯是无性繁殖作物，生长过程中会受到病毒的侵染并且不断积累，导致种薯退化减产。病毒病是马铃薯生产上的主要病害之一，其危害程度仅次于晚疫病，是马铃薯生产中极难解决的问题[3]。自1916 年第一个马铃薯病毒病被发现以来，目前已发现40 多种病毒侵染马铃薯，我国已报道的有16 种[4-5]。危害我国马铃薯生产的主要病毒有PVX、PVY、PVS、PVM、PVA 和PLRV，其中马铃薯Y 病毒（PVY）危害最为严重[6]。PVY是马铃薯生产中最常见的一种病毒，可引起花叶、皱缩、坏死等症状。它是全球分布范围最广、破坏性最大的马铃薯病毒之一，几乎遍布所有的马铃薯种植区[7]。马铃薯感染PVY 后一般减产50%，当与其他病毒复合侵染后，最高可减产80%[8]。马铃薯X 病毒（PVX）又称普通花叶病毒，一般只产生轻微症状，产量损失可达10%～40%，若与PVY 或PVA 复合侵染可导致块茎产量损失80%以上[9-10]。目前，针对马铃薯病毒病缺乏有效的防治措施，主要通过茎尖脱毒技术或者选育抗病毒的马铃薯品种，其中培育抗病毒品种是控制病毒最为简便快捷、经济有效的途径[11-12]。

筛选高抗马铃薯病毒病的资源，发掘抗病基因对防控马铃薯病毒病具有重大的意义。随着马铃薯病毒病抗性基因的克隆及抗性遗传研究发展，开发分子标记进行辅助选择，筛选出具有抗性基因的马铃薯品种是一个快捷、精准的方法[13-14]。在引起马铃薯病毒病的病毒中，PVY 和PVX 是危害比较严重的2 种病毒。目前已经发现3 个PVY抗性基因Ryadg[15]、Rysto[16]和Rychc[17]，对PVY 具有极端抗性。Ryadg来源于安第斯亚种（Solanum tuberosumssp.andigena），1996 年被定位在11 号染色体的末端[18]，根据Ryadg基因开发的标记RYSC3 在国外育种中已经成功应用[19-20]。Rysto是马铃薯抗PVY 的显性基因，来源于S.stoloniferum[21]，该基因也定位在11 号染色体，开发的STS 标记YES3-3B 被用于检测Rysto基因[22]。Rychc是显性单基因，从日本品种‘Konafubuki’中发现，被定位在9 号染色体的末端[23]，根据该基因开发的STS 标记Ry186 用于检测Rychc极端抗性[24]。Rx基因对PVX 具有极端抗性，可以快速地抑制病毒在最初感染的细胞中的积累[25]，Rx1来源于安第斯亚种，定位于12 号染色体上。Mori等[26]根据Rx1基因序列开发了STS 标记Rxsp，重组率为1.3%，说明其与Rx1紧密连锁。

常规的抗病育种选择周期长、效率低，选育过程需要花费大量的时间、财力和物力，但利用分子标记辅助育种（MAS），可在育种早期进行快速检测，而且不受环境条件的限制，可加速育种进程，提高育种选择效率。本研究利用与抗PVY的基因Ryadg、Rysto、Rychc紧密连锁的分子标记RYSC3、YES3-3B、Ry186 和抗PVX 的基因Rx紧密连锁的分子标记Rxsp，对102 份主要育成品种进行标记检测，目的是筛选出具有多个病毒抗性基因的马铃薯品种，为马铃薯抗病毒育种提供宝贵资源，同时为马铃薯分子标记聚合育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为国家马铃薯种质资源试管苗库（克山）保存的102 份马铃薯种质资源的脱毒试管苗，主要选择国内各育种单位近几年登记的品种及部分野生种和原始栽培种。

1.2 马铃薯基因组DNA 提取

取试管苗顶部茎叶，使用天根DP-320 试剂盒提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 质量，DNA 样品保存于-20℃冰箱。

1.3 PCR 和电泳

分子标记信息见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反应体系20μL：2×TaqPCR Master Mix 10μL、正反引物各1μL、DNA 模板1μL、ddH2O 7μL。PCR 扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃～59℃退火40s，72℃延伸1min，35 个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR 结束后，取4μL 扩增产物与2μL 6×Loading Buffer 混匀，于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并拍照。

表1 分子标记信息Table 1 Information of molecular markers

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 的提取

对供试的102 份材料进行基因组DNA 的提取。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA 主带清晰，无拖尾、降解现象。各样品间DNA 浓度均匀一致，纯度高，质量好（图1）。

图1 DNA 浓度与质量检测Fig.1 Examination of DNA concentration and quality

2.2 PVX 抗性基因分子标记Rxsp 的检测

根据与马铃薯PVX 抗性基因Rx1连锁标记Rxsp 的扩增结果（图2）显示，含Rxsp 标记的材料可以扩增出约1230bp 的特异性片段，102 份材料中有11 份材料含有Rxsp 标记，占供试材料的10.78%。

图2 部分材料Rxsp 标记扩增Fig.2 The PCR of Rxsp marker of part of accessions

2.3 PVY 抗性基因分子标记RYSC3、YES3-3B、Ry186 的检测

根据与马铃薯PVY 抗性基因Ryadg连锁标记RYSC3 的扩增结果（图3）显示，含RYSC3 标记的材料可以扩增出约321bp 的特异性片段，102 份材料中有95 份材料含有RYSC3 标记，占供试材料的93.14%。含YES3-3B 标记的材料可以扩增出约284bp 的特异性片段（图4），102 份材料中有101 份材料含有YES3-3B 标记，占供试材料的99.02%。含Ry186 标记的材料可以扩增出2～3 条带（图5），能够扩增出587bp 的片段记为含有Ry186 标记，102 份材料中有35 份材料含有Ry186标记，占供试材料的34.31%。

图3 部分材料RYSC3 标记扩增Fig.3 The PCR of RYSC3 marker of part of accessions

图4 部分材料YES3-3B 标记扩增Fig.4 The PCR of YES3-3B marker of part of accessions

图5 部分材料Ry186 标记扩增Fig.5 The PCR of Ry186 marker of part of accessions

2.4 102 份马铃薯品种病毒抗性标记分析

表2 列出了不同品种抗性标记的分布情况，其中只含有1 个标记的品种有4 个，占供试材料的3.92%；同时含有2 个标记的品种有62 个，占供试材料的60.78%；同时含有3 个标记的品种有30 个，占供试材料的29.41%；同时含有4 个标记的品种有6 个，占供试材料的5.88%。

表2 不同品种抗性标记分析Table 2 Analysis of markers of distinct varieties

3 讨论

马铃薯是我国重要的粮菜兼用作物，但长期以来育种工作因为病毒感染而进展缓慢，很多优异材料在选种的过程中由于病毒侵染没有及时脱毒处理而被淘汰掉，而随着育种圃场规模的增加和病毒变异的加快，育种材料的脱毒工作日益繁重，因此，抗病毒育种在马铃薯育种工作中的重要性就凸显出来。培育马铃薯抗病品种首先就需要扩大遗传背景和丰富遗传多样性，鉴定并筛选出抗病品种是获得抗病亲本材料的最基础有效的手段之一。常规的病毒抗性鉴定方法周期长、效率低，而分子标记辅助选择运用分子标记技术可以快速筛选出具有不同抗性标记的材料。

本研究利用4 个与马铃薯病毒病抗性基因连锁的分子标记（Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186）对102 份马铃薯品种进行检测，结果表明，所有检测的材料至少含有1 个抗性标记，其中同时含2 个标记的品种最多，同时含4 个标记的品种只有6 份。在6 份野生种和原始栽培种中都至少含有2 个抗性标记，说明野生种和原始栽培种中含有丰富的抗病毒基因，这些资源的利用对马铃薯育种工作起着决定性的作用。生产实践证明，在生产上能够较长期发挥作用的品种，除了品质好、产量高等性状外，抗病性好也是重要的原因，如克新1 号自1965 年开始推广，由于高抗环腐病、抗PVY 和PLRV 并且耐旱和高产，到目前为止仍有较大种植面积[29]。

本研究表明，所有供试材料中含有YES3-3B标记的品种最多，为101 份，占供试材料的99.02%，含有Rxsp 标记的品种最少，为11 份，占供试材料的10.78%，这与黄鑫华等[30]的研究结果一致，并且检测到陇薯10 号、冀张薯5 号和云薯401 同时含有RYSC3 和YES3-3B 标记，内薯7 号同时含RYSC3、YES3-3B 和Ry186 标记，大同里外黄同时含Rxsp、RYSC3 和YES3-3B 标记，这与黄鑫华等[30]研究结果也相符，但与白磊等[11]的研究结果不同。白磊等[11]研究认为，陇薯10 号不含RYSC3 和Ry186 标记、黑美人不含RYSC3 和Ry186 标记（本研究中黑美人同时含RYSC3 和YES3-3B 标记）、陇薯11 号只含RYSC3 标记（本研究中陇薯11 号同时含Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186 标记），造成这一结果差异的原因还不清楚。本研究还检测到克新23 号和克新25 号均含有RYSC3、YES3-3B和Ry186 标记，2 个品种是姊妹系，基因来源于同一个父母本。

分子标记技术作为一种辅助选择手段，与人工接种病毒鉴定结果不能100%吻合，所以我们下一步的研究方向是对筛选出的含有多个抗性标记的材料进行人工接种鉴定，以确定其病毒抗性组成，并且依托国家马铃薯种质资源试管苗库（克山）平台，加大对资源库保存资源病毒抗性分子标记的检测，筛选出含有多个不同抗性标记的材料作为亲本用于聚合育种，在育种早代进行分子标记检测，结合产量、品质等性状综合评价，创造出聚合多个抗性基因的优异材料，提高育种效率，缩短育种年限，真正做到分子标记辅助选择与聚合育种有效结合。

4 结论

本研究利用抗PVY 和抗PVX 基因的分子标记对102 份育成品种、野生种和原始栽培种进行标记检测，结果表明，含有YES3-3B 标记的材料最多，占比99.02%；含有Rxsp 标记的材料最少，占比10.78%；只含有1个标记的品种有4个，占比3.92%；同时含有2 个标记的品种有62 个，占比60.78%；同时含有3 个标记的品种有30 个，占比29.41%；同时含有4 个标记的品种有6 个，分别是陇薯11号、S.acaule、富金、云薯105、晋薯8 号和大西洋，占供试材料的5.88%。