不同氮效率品种小麦根际土壤酶活性和细菌群落的差异

宋晓 张珂珂 岳克 黄晨晨 黄绍敏孙建国 郭腾飞 郭斗斗 张水清 裴敏楠

（1 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，450002，河南郑州；2 河南省农业生态环境重点实验室，450002，河南郑州；3 濮阳市土壤肥料工作站，457000，河南濮阳）

土壤酶和土壤微生物是土壤中多种生化反应、物质循环和能量代谢的重要参与者，在养分循环、有机质分解及污染物降解方面发挥关键作用，可以表征土壤肥力和土壤健康状况[1-2]。根际是植物、土壤、微生物及其生长环境的一个重要衔接平台，是根系与土壤交界的微域[3]。分析和比较不同作物的根际土壤酶活性及微生物群结构等微生态特性，有利于从微生态学角度为作物低肥高效栽培提供理论依据。

小麦是我国重要的粮食作物之一，小麦产业发展直接关系到我国粮食安全和社会稳定。近年来，我国小麦连年增产，但同时伴随着氮肥的过量施用及肥效下降，从而影响生态环境的健康发展，导致土壤酸化、温室效应及生物多样性丧失等一系列的生态环境问题[4-5]。基于经济效益和生态环境保护的双重要求，相关学者已就小麦“肥药双减”问题开展了不同角度的研究。张娟娟等[6]通过不同氮效率小麦品种的氮素营养诊断研究发现，不同品种的氮吸收利用效率、根系活力及耐低氮胁迫能力不同。熊淑萍等[7]研究分析不同基因型小麦根系吸收特性与地上部氮素利用的差异发现，不同氮效率基因型小麦氮素吸收利用的生理机制。近年来，粮食―土壤可持续生产力与植物根际微生物区系的关系逐渐被关注[8-9]。董航宇[10]从根际微生态角度研究了土壤微生物、土壤酶活性与粳稻高效利用氮的关系。杨珍等[11]基于作物根际微域探究植物病害发生机理，挖掘具有潜力的微生物资源；相反，通过根际微域中的土壤酶活性和微生物多样性也能体现出不同作物或者同一作物不同品种间的差异[12-13]。目前关于小麦根际土壤微生态区系的研究多集中在氮素的吸收、利用及耕作方式方面[7,14]，关于不同氮效率小麦品种的根际微生物和土壤酶活性差异的研究较少。本研究在前期氮效率筛选试验的基础上，选择氮效率有显著差异的2 个基因型小麦品种，综合分析不同氮效率小麦根系活力、根际土壤酶活性和微生物群落多样性的差异，为小麦生产上的品种选择以及土壤生产力的维持提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2018-2020 年度在河南省新乡市原阳县平原示范区河南现代农业研究开发基地（全国潮土肥力和肥料效益长期监测试验站，113.41°E，35.00°N）开展。该站地处黄淮海平原，处于热带向暖温带过度地带，属于大陆性季风气候，年均降水量645mm，平均日照时数12h，年均气温14.4℃，无霜期224d。供试土壤为潮土，土壤地力均匀，0～30cm 耕层土壤含有机质14.39g/kg、碱解氮82.6mg/kg、有效磷14.7mg/kg、有效钾89.9mg/kg、全氮0.88g/kg。

1.2 试验设计

设置不施氮0k g/hm2（N0）和正常施氮165kg/hm2（N1）2 个供氮水平；供试品种为氮高效小麦品种许科168 和氮低效小麦品种郑品麦8号[15]，小区随机排列，小区面积54m2（6m×9m），行距20cm，重复3 次。氮肥为尿素（含N 46%），磷肥为磷酸二氢钙（含P2O512%）687.5kg/hm2，钾肥为硫酸钾（含K2O 57%）144.74kg/hm2。氮肥按基肥:追肥=5:5 施入，追肥于返青期开沟施入，磷肥和钾肥在播前作为基肥一次性施入，其他栽培管理措施同一般高产田。分别于2018 年10 月12 日和2019 年10 月14 日播种，播种量为150kg/hm2，分别于2019 年6 月1 日和2020 年6 月3 日收获。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 根系活力 分别于返青期、拔节期、孕穗期、灌浆期和成熟期采样后冲洗根部，取根尖处5cm 的根系，采用改良TTC 还原法测定根系活力[16]。

1.3.2 根际土壤酶活性 于小麦孕穗期每个试验小区内随机选取3 个点，将植株连根挖出，采用抖土法收集根际土（距离根系周围0～5mm），于4℃条件下保存并尽快带回实验室，过2mm 筛后，除去根系残体，自然风干过0.25mm 筛，鲜样保存在-80℃冰箱，用于测定土壤细菌群落、β-葡萄糖苷酶（β-glocusidase，BG）、亮氨酸氨基肽酶（leucine amiopeptidase，LAP）和多酚氧化酶（POX）活性。采用微孔板荧光分析法[17]测定BG 和LAP 活性，测定原理是BG 分解底物生成对硝基苯酚，后者在400nm 有最大吸收峰；LAP 分解底物生成对硝基苯胺，后者在405nm 有最大吸收峰；采用微孔板比色法[18]测定POX 活性，测定原理是POX 可催化底物生成有色产物，其显色物质在460nm 处有最大吸收峰。3 种酶的底物见表1。根据测定原理，使用酶标仪（Labsystems Multiskan，MS，芬兰）在特定波长下读取吸光值，通过测定吸光值升高速率来计算各种土壤酶活性。所得结果统一单位为nmol/(h•g)，即每小时每克鲜土分解相应底物产生特定产物的物质的量。

表1 土壤酶及其底物Table 1 Soil enzyme names and their substrates

1.3.3 微生物高通量测序 利用Illumina MiSeq 平台（Illumina Inc.，San Diego，CA，美国）标准操作规程，对土壤微生物群落进行测序[19-20]。PCR扩增16S rRNA 基因的V3-V4 高变区，对于每个DNA 样品，在ABI GeneAmp 9700 PCR 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）上使用TransStart Fastpfu DNA 聚合酶对3 个重复进行独立的PCR 扩增，使用AxyPrep PCR 纯化试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，美国）进行纯化，并使用Illumina MiSeq 平台进行双末端测序。

1.4 数据处理

首先使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）（v1.2.1）对测序结果的原始数据进行拼接、过滤，并去除嵌合体。挑出序列长度大于200bp、Barcode 和引物序列无错误碱基、平均质量得分Q≥25 的高质量序列。采用USEARCH软件在97%的阈值下划分分类操作单元（OTU）。根据Silva 数据库，比对OTU 代表序列并进行分类。利用Mothur 软件计算Shannon、Simpson 多样性指数及Chao、ACE 丰富度指数，用于评价细菌α-多样性[21]。

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0 等软件完成统计分析。采用OriginPro 8.1、Microsoft Excel 2010 与Microsoft PowerPoint 2010 完成图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同氮效率小麦品种根系活力差异

图1 显示，2 年的根系活力结果趋势一致，许科168 和郑品麦8 号的根系活力均随着生育进程呈先增加后降低的趋势，孕穗期的根系活力最强。N0和N1 处理下，许科168 的根系活力均高于郑品麦8 号；与郑品麦8 号相比，N0 处理下，2018-2019年度返青期―成熟期许科168 的根系活力平均增加33.49%，2019-2020 年度平均增加36.15%；N1 处理下，2018-2019 年度平均增加53.59%，2019-2020年度平均增加60.66%。另外，增施氮肥提高了2个品种的根系活力，与N0 处理相比，2018-2019年度N1 处理下许科168 的根系活力平均增加了26.06%，郑品麦8 号平均增加了9.91%。

2.2 不同氮效率小麦品种的根际土壤酶活性差异

孕穗期2 个施氮处理下不同氮效率小麦品种的根际土壤酶活性如表2 所示，许科168 的根际土壤酶活性均高于郑品麦8 号，其中N0 处理下，BG、LAP 和POX 活性平均增幅分别为59.35%、34.43%和30.50%，且差异达显著水平；N1 处理下平均增幅分别为9.31%、18.88%和9.05%。

表2 不同基因型小麦根际土壤酶活性的差异Table 2 Differences of soil enzyme activities in the rhizosphere of different genotypes of wheatnmol/(h∙g)

2.3 不同氮效率小麦品种对根际土壤细菌α-多样性的影响

从不同氮处理下土壤细菌α-多样性特征（表3）可以看出，N0 处理下，氮高效小麦品种许科168 的丰富度指数和多样性指数均高于氮低效小麦品种郑品麦8 号，其中Chao、ACE 和Shannon 指数达到显著差异水平。N1 处理下，许科168 和郑品麦8号的丰富度指数和多样性指数差异不显著。

表3 不同氮效率小麦品种根际土壤细菌α-多样性特征Table 3 Characteristics of α-diversity of rhizosphere soil bacteria in wheat varieties with different nitrogen efficiency

2.4 不同氮效率小麦品种对根际土壤细菌群落结构的影响

对土壤细菌群落在门水平上进行分类，2 个处理共含有28 个门，相对丰度大于1%的门有11 个（图2），其中酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门和奇古菌门为优势门，相对丰度为84.36%～88.20%。与N0 处理相比，N1 处理下氮高效小麦品种许科168 的酸杆菌门和疣微菌门的相对丰度分别降低了38.68%和28.16%，拟杆菌门、绿湾菌门和厚壁菌门相对丰度分别增加了17.68%、66.50%和59.68%；而氮低效小麦品种郑品麦8 号的酸杆菌门、浮霉菌门和疣微菌门则增加了62.36%、40.79%和50.18%，绿湾菌门降低了32.84%。同一处理下，2 个品种优势门丰度也有差异，N0 处理下，许科168 的酸酐菌门比郑品麦8号增加了66.21%，奇古菌门降低了11.74%，N1 处理下许科168 的酸酐菌门比郑品麦8 号降低了37.23%，奇古菌门则增加了13.30%，其他差异不明显。

图2 不同氮效率小麦品种的根际土壤细菌群落在门水平上的相对丰度Fig.2 Relative abundance of rhizosphere soil bacterial communities at the phylum level in wheat varieties with different nitrogen efficiency

进一步对比分析发现，2 个处理共含有857 个属，其中GP6 属和亚硝基球藻（Nitrososphaera）为优势属（图3）。与氮低效品种郑品麦8 号相比，N0 处理下，许科168 根际土壤的亚硝基球藻显著增加了38.06%，GP6 属显著降低了21.33%；在N1处理下，许科168 根际土壤亚硝基球藻属显著增加了21.79%，GP6 属降低了9.49%。

图3 不同氮效率小麦品种的根际土壤优势细菌属的相对丰度Fig.3 The relative abundance of rhizosphere soil predominant bacterial genera of wheat varieties with different nitrogen efficiency

3 讨论

3.1 小麦根系活力特征

根系是植物的重要作用器官，具有固定和支撑植物的功能，影响植物对养分、水分和矿物质等的吸收，同时又是多种离子、有机酸和氨基酸等合成的重要场所[22-23]。小麦属于须根系作物，根系活力的大小一定程度反映了根系新陈代谢活动的强弱[12]。根系活力与作物的品种、土壤类型、肥水措施及自身基因遗传性状等密切相关[24-25]；它反映了作物根系吸收、合成、呼吸和氧化能力等，客观体现了根系新陈代谢能力的强弱[26-27]。熊淑萍等[7]研究认为，氮高效基因型小麦根系具有较高的活力及根系代谢能力。本研究结果也证实了这一点，不论在低氮或高氮水平下，氮高效小麦品种许科168 的根系活力均高于氮低效小麦品种郑品麦8 号，低氮处理下差异显著。

3.2 根际土壤酶活性特征

土壤酶是由动物、植物和微生物产生的[28-29]，它不仅是土壤中物质循环和能量转换的重要参与者，还是土壤进行一切生化反应的催化剂[30]。土壤酶活性的高低可以代表土壤中物质代谢的旺盛程度，在一定程度上反映了作物对氮素的吸收利用与生长发育状况等，是表征土壤肥力的重要指标[31-32]。本研究结果表明，施用氮肥提高了土壤酶活性，与N0 处理相比，N1 处理下BG、LAP 和POX 活性平均增加63.63%、32.35%和13.41%，这可能是由于微生物通过同化利用这些施入的氮素能够促进自身的生长，导致产生的酶量和活性均显著增加[33]。显然，氮肥施用与土壤酶之间存在着密不可分的关系。研究[32]表明，同一氮素水平下不同氮效率品种对根际土壤酶活性的响应也有一定的影响。本试结果表明，2 种施氮处理下，与氮低效品种郑品麦8号相比，氮高效品种许科168 的BG、LAP 和POX活性均增加；N0 处理下增加幅度分别为59.35%、34.43%和30.50%，达到差异显著水平；N1 处理下增加幅度分别为9.31%、18.88%和9.05%。较高的土壤酶活性代表土壤的物质和能量转化都很旺盛，从而促进了植株的良好生长[34-35]，这也进一步证实了氮高效小麦品种在低氮胁迫条件下具有良好的适应能力[7]。

3.3 根际土壤细菌群落结构多样性特征

土壤微生物是农田土壤生态系统中最活跃的重要成分之一，其种类丰富，数量繁多，在土壤有机质矿化分解及腐殖酸形成中扮演重要角色。微生物多样性和群落丰富度被视为衡量土壤肥力状况的重要指标[36-37]，其与作物的种类有一定的相关性[38-39]。在本研究中，基于高通量测序分析结果，不同氮肥处理间主要菌群种落基本相似，其主要差异表现在菌群丰度上；N0 处理下，不同氮效率小麦品种根际微生物的丰富度指数和多样性指数存在显著差异，N1 处理下差异不显著，其根本原因在于不同氮效率小麦品种的根系活力和根际土壤酶活性等差异影响了土壤细菌群落结构的分布。N0处理下，许科168 根际土壤酸杆菌门相对丰度明显高于郑品麦8 号，N1 处理下表现相反。这可能是因为酸杆菌门属于贫营养型菌，生长速率缓慢，富集在养分含量较低环境中，而N0 处理下氮高效品种许科168 的根系与根际土壤的相互作用有利于根际微生物的生长，从而提高了根际土壤微生物的活性。同时，N0 处理下许科168 根际土壤奇古菌门的相对丰度明显低于郑品麦8 号，这可能与选择的生育时期及土壤环境有关[40]，因为不同生育期不同氮效率小麦品种吸收土壤有效氮程度不同，影响了土壤氮库的平衡，不同程度地改变了土壤性质，从而影响了土壤微生物群落[41]。

4 结论

不同氮效率小麦品种的根系活力存在一定差异，品种间的差异不仅存在于处理之间，也表现在同一处理下根际土壤酶活性及根际微生物区系上；尤其在低氮条件下，不同品种间根际土壤酶活性和根际微生物主要菌群丰度存在显著差异。因此，氮高效小麦品种能够增强土壤酶活性，提高细菌群落多样性并改善细菌群落组成。