外源褪黑素对干旱胁迫下红小豆幼苗生长和产量的影响

姜珊 刘佳 曹亮 任春元 金喜军 张玉先

（黑龙江八一农垦大学农学院，163319，黑龙江大庆）

红小豆（Vignaangularis）为豇豆属一年生草本植物，又名小豆、赤豆[1]。其营养价值高，具有生育期短、耐瘠薄、适应性广等特点。黑龙江省大部分地区位于中温带，适宜种植食用豆类作物[2]，是我国重要的红小豆主产区之一。但以雨养为主的农业生产模式决定了作物产量受自然降雨的影响较大，而黑龙江省受寒温带与温带大陆性季风气候控制，春季年际间降水量变化大、分布不均引起的局部干旱是红小豆生产中主要农业灾害之一[3]。春旱严重抑制作物苗期生长[4-5]，进而在一定程度造成产量和品质下降。干旱胁迫导致气孔关闭、活性氧（ROS）过度积累、细胞器遭到破坏，进而引起生理代谢功能发生紊乱，最终导致作物减产[6]。

褪黑素作为一种新型植物生长调节剂，在调节植物生长发育、抵抗逆境方面有重要作用。如褪黑素可以提高干旱胁迫下小麦的光合速率和叶绿素含量[7-8]，增强大豆苗期抗冷性[9]，提高高温胁迫下黄瓜幼苗的抗氧化酶活性及抗氧化物质含量，减轻高温对幼苗造成的伤害[10]，还可提高盐胁迫下水稻幼苗的渗透调节能力，清除过量ROS，从而增强水稻幼苗耐盐性[11]。

虽然大量研究证实了褪黑素在调控植物生长发育，尤其在促进逆境胁迫下植物生长和产量提高方面有积极作用。但目前缺少褪黑素调控红小豆抗旱能力和产量的研究报道。因此，本研究通过盆栽控水方式模拟干旱胁迫，研究了叶面喷施褪黑素对干旱胁迫下苗期红小豆抗旱和光合生理以及最终产量的影响，为实际生产中提高红小豆产量提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019 年在黑龙江省大庆市国家杂粮工程技术研究中心试验基地遮雨大棚进行，以黑龙江省主栽红小豆品种珍珠红为供试材料，褪黑素购自Sigma 公司。

盆栽塑料桶（高33cm，直径30cm）桶底铺双层纱网，钻6 个直径1cm 小孔。培养基质为珍珠岩、蛭石和黑钙土，按照1:3:12 的比例混合均匀，每桶装入16kg 混合基质。挑选大小均匀、无破损和病斑的红小豆种子，先用5% NaClO 溶液消毒10min，再用蒸馏水反复冲洗5 次，放置于阴凉通风处阴干。播种前用自来水将培养土浇透，次日均匀摆放9 粒红小豆种子后，表面覆盖2kg 混合基质。待红小豆幼苗达到V1 期定苗，每盆保留3 株。在播种完成后，通过环刀法测定田间水量，并通过烘干法测出每桶干土重量，用于计算控水标准。

1.2 试验设计

于V2 期选取长势一致的材料平均分成3 组，采用定期称重法结合定量控水逐渐控制土壤含水量达到目标含水量。设置3 个处理，分别是正常供水（对照，CK，维持80%田间持水，每天18:00通过称重法确定蒸发和蒸腾失水量，采用量筒补充水分）、干旱胁迫处理（D，每天18:00 通过称重法确定蒸发和蒸腾失水量，直至达到50%田间持水量后，采用量筒补充每天损失水分以维持50%田间持水量）、干旱胁迫下叶面喷施褪黑素处理（D+M，控水和补充水分方式与D 处理相同，并于控水当晚20:00 开始叶面喷施100μmol/L 褪黑素，此浓度为前期预备试验明确，连续喷施叶片5d），CK 和D处理叶面喷施等量蒸馏水。喷施褪黑素当天记为第1 天，达到干旱胁迫（50%田间持水量）为第7 天，分别于10、15、20、25、30d 取样（25d 取样后复水），测定相关指标。3 个处理分别取样5 次，每个处理每次取样5 盆用于测定生理指标或形态指标，成熟期每个处理保留5 盆用于测产，共计播种90 盆。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 气体交换参数 于取样当天9:00 选取完全生长的倒2 叶片采用Li-6400 光合仪（LiCor，Huntington Beach，CA，美国）测定净光合速率（Pn）、叶片气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（Ci）。测定光强为1200μmol/(m2·s)，CO2供应浓度为400CO2/mol，叶片温度25℃，相对湿度约25%，每个处理5 次重复。

1.3.2 叶绿素荧光分析 叶绿素荧光参数采用便携式叶绿素荧光仪（FMS-2，Hansatech）在设定光强下测定红小豆叶片的测定植株顶部向下第2片完全展开功能叶片的叶绿素荧光参数。测定前将叶片暗适应15min，以弱检测光测定初始荧光（Fo），之后以饱和脉冲光测定最大荧光（Fm）。当荧光从Fm回落至接近Fo时，以连续的作用光测定稳态荧光（Fs）；之后叠加一个饱和脉冲光，测定光下最大荧光（Fm'）；最后关闭作用光，并立即打开远红光，测定光下最小荧光（Fo'）；可变荧光（Fv）=Fm–Fo，PSⅡ的最大光化学效率=Fv/Fm、PSⅡ的量子产额（ΦPSII）=(Fm'–Fs)/Fm、最大光能转化潜力（Fv/Fo）=(Fv/Fm)/(1–Fv/Fm)，每个处理3 次重复。

1.3.3 叶绿素和碳水化合物含量 称取0.2g 红小豆倒2 叶功能叶片浸泡于20mL 无水乙醇中，常温暗处理24h，参照胡秉芬等[12]方法测定叶绿素含量，按照以下公式计算，

叶绿素a（Chl a）=13.95OD665–6.88OD649

叶绿素b（Chl b）=24.96OD649–7.32OD665

总叶绿素含量=Chl a+Chl b

参照文献[13-14]测定可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉含量。

1.3.4 抗氧化酶活性 取样当天取完成生长的倒2叶放入液氮中30min，然后储存于-20℃用于测定抗氧化酶活性。根据文献[15]测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，根据文献[16]测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，每个处理3 次重复。

1.3.5 渗透调节物质和膜脂过氧化水平 采用磺基水杨酸法测定游离脯氨酸（Pro）含量，采用考马斯亮蓝G-250 比色法[17]测定可溶性蛋白含量，采用硫代巴比妥酸法（TBA）[18]测定丙二醛（MDA）含量，用电导率仪（DDS-307）[19]测量相对电导率，采用Chaitanya 等[20]的方法测定超氧阴离子（O2–.）含量，参照Mukherjee 等[21]的方法测定H2O2含量。

1.3.6 形态指标和产量 于处理后10、15、20、30d每次取样5 盆（共15 株），采用直尺测量株高（cm），采用游标卡尺测量茎粗（mm），采用天平测定地上和地下部分（根系）干重（g），采用Yaxin-1241叶面积仪测量叶面积（mm2）。

于成熟期进行收获测产，每个处理取5 盆（共15 株），进行单株荚数、单株粒数、单株粒重和百粒重的考察，以单株粒重表示产量。

1.4 数据处理

用SPSS 2.0 软件进行数据统计分析，用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对干旱胁迫条件下红小豆幼苗生长的影响

如表1 所示，干旱胁迫对红小豆幼苗株高和茎粗起明显抑制作用。与CK 相比，D 处理后25d 内株高、茎粗、叶面积、地上和地下干重降低幅度分别为16.37%～29.09%、10.13%～14.96%、14.93%～23.90%、12.79%～43.52%和18.18%～45.45%，并随着干旱胁迫时间延长抑制作用越明显。施用外源褪黑素可以提高红小豆株高和茎粗，与D 相比，D+M处理后25d 内上述指标提高幅度分别为7.04%～14.37%、3.65%～6.44%、12.12%～17.74%、7.41%～29.55%和6.59%～22.58%。结果表明，褪黑素在一定程度上能够缓解干旱胁迫对红小豆生长的抑制。

表1 干旱胁迫条件下褪黑素对形态指标的影响Table 1 Effects of melatonin on growth of adzuki bean seedlings under drought stress

2.2 褪黑素对干旱胁迫下红小豆抗逆生理指标的影响

2.2.1 对抗氧化酶活性的影响 如图1 所示，干旱胁迫显著提高了红小豆叶片内SOD、POD、APX和CAT 活性，随干旱胁迫时间的延长SOD、POD、APX 和CAT 活性呈先上升后下降的趋势。与CK相比，D 处理后20d 内叶片SOD、POD 和APX 活性提高幅度分别为7.72%～28.36%、9.61%～17.02%、8.23%～14.94%，CAT 活性在25d 内提升幅度为17.21%～33.01%。施用褪黑素可提高干旱胁迫下叶片内SOD、POD、APX 和CAT 活性，与D 处理相比，D+M 处理后25d 内叶片SOD、POD、CAT 和APX 活性提高幅度分别为2.79%～10.78%、2.08%～24.39%、2.52%～19.38%、1.72%～9.37%。复水后，D+M 处理SOD、POD、CAT 和APX 活性仍高于D处理，由此可知，外源褪黑素可显著提高干旱胁迫下红小豆叶片内抗氧化酶活性，缓解干旱胁迫对叶肉细胞的氧化损伤，提高红小豆的抗旱能力。

图1 干旱胁迫下褪黑素对抗氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of melatonin on antioxidant enzyme activities under drought stress

2.2.2 对膜脂过氧化与渗透调节物质的影响 如图2 所示，干旱胁迫导致红小豆叶片中、MDA和H2O2含量显著上升，并随着干旱胁迫时间的延长呈先上升后下降的趋势。与CK 处理相比，D 处理后25d 内叶片中、MDA 和H2O2含量分别增加了34.76%～68.96%、30.16%～44.94%、18.01%～38.89%。施用外源褪黑素在一定程度上降低了、MDA 和H2O2含量，与D 处理相比，D+M 处理后25d 内叶片中、MDA 和H2O2含量分别降低13.02%～43.13%、12.70%～23.60%，8.87%～20.30%。复水后D 处理的、MDA 和H2O2含量仍高于D+M 处理。由此可知，干旱胁迫下褪黑素可以降低叶片中ROS（H2O2和）含量，缓解叶片中ROS 对植物细胞的损伤，且复水后褪黑素可以提高植株恢复能力，维持植株叶片组织ROS的平衡。

图2 干旱胁迫下褪黑素对膜脂过氧化的影响Fig.2 Effects of melatonin on membrane lipid peroxidation under drought stress

干旱胁迫造成红小豆叶片中渗透调节物质可溶性蛋白、Pro 含量和相对电导率显著提高。与CK相比，D 处理可溶性蛋白、Pro 含量和相对电导率分别增加8.89%～21.76%、8.33%～43.33%、20.00%～27.69%。施用外源褪黑素可进一步增加可溶性蛋白和Pro 含量，降低相对电导率，与D 处理相比，D+M 处理25d 内叶片中可溶性蛋白和Pro 含量分别增加了3.80%～7.50%、0.53%～11.31%，相对电导率降低了5.36%～16.67%。复水后经D 处理的渗透调节物质含量及相对电导率仍高于D+M 处理。由此可知，干旱胁迫下叶片渗透调节物质显著增加，叶片相对电导率上升，外源褪黑素可进一步增加渗透调节物质的含量，降低渗透势和相对电导率，稳定叶片细胞结构，进而增强抗旱能力。

2.3 干旱胁迫下褪黑素对红小豆光合生理指标的影响

2.3.1 对光合参数的影响 由图3 所示，干旱胁迫显著降低了红小豆Pn、Tr、Gs和Ci，随着干旱胁迫时间的延长呈逐渐下降趋势。与CK 相比，D 处理后25d内上述指标分别下降了32.13%～49.87%、18.90%～58.26%、21.57%～46.12%和11.60%～27.97%。喷施外源褪黑素可以缓解干旱胁迫下红小豆Pn、Tr、Gs和Ci的降低，与D 处理相比，D+M 处理后25d 内上述指标分别增加了8.65%～28.55%、8.00%～35.65%、6.53%～15.54%和4.56%～12.78%。复水后D+M 处理上述指标的恢复效果较D处理更好，但D和D+M处理均未恢复到CK 水平。由此可知，外源褪黑素处理能有效提高红小豆在干旱胁迫下叶片光合能力，促进叶片中物质积累。

图3 干旱胁迫条件下褪黑素对红小豆光合参数的影响Fig.3 Effects of melatonin on photosynthetic parameters of adzuki bean under drought stress

2.3.2 对荧光参数的影响 由图4 可知，干旱胁迫显著降低了光系统Ⅱ的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和表观电子传递速率（ETR）。与CK 相比，D 处理25d 内叶片中Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 分别下降了4.76%～44.12%、3.97%～22.01%、5.08%～31.67%、4.73%～31.92%。施用外源褪黑素不同程度地缓解了干旱胁迫下上述指标的下降程度，与D 处理相比，D+M 处理25d 内上述指标分别增加了1.64%～18.18%、2.68%～10.71%、5.08%～19.61%和1.44%～15.60%。复水后经褪黑素处理的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 恢复效果较D 处理更好，但均未达到显著水平。因此，外源褪黑素处理能有效提高红小豆在干旱胁迫下叶片荧光参数，提高光合效率。

图4 干旱胁迫条件下褪黑素对红小豆叶绿素荧光参数的影响Fig.4 Effects of melatonin on chlorophyll fluorescence parameters of adzuki bean under drought stress

2.3.3 对光合色素含量的影响 由图5 可知，干旱胁迫显著降低了叶片中叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量，随着干旱胁迫时间的延长，上述指标的下降幅度逐渐增大。与CK 相比，D 处理25d 内叶片中叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量分别下降了17.54%～43.66%、8.22%～41.98%、15.66%～42.77%。施用外源褪黑素不同程度地缓解了干旱胁迫下叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量下降程度，与D处理相比，D+M 处理后25d 内上述指标分别增加了10.77%～15.74%、7.09%～28.51%和9.60%～15.52%。复水后D+M 处理的光合色素含量较D 处理恢复效果更好，但仍未达到显著水平。因此，施用外源褪黑素处理可在一定程度上缓解干旱胁迫下光合色素的降低，促进叶片对光能的吸收。

图5 干旱胁迫条件下褪黑素对红小豆光合色素含量的影响Fig.5 Effects of melatonin on photosynthetic pigment contents of adzuki bean under drought stress

2.3.4 对糖类物质含量的影响 由图6 可知，干旱胁迫显著提高了叶片内果糖、蔗糖和可溶性糖含量，降低了淀粉含量。可溶性糖和淀粉含量随干旱胁迫时间延长呈逐渐下降趋势；果糖和蔗糖含量则呈先上升后下降趋势。与CK 相比，D 处理后25d内叶片中果糖、蔗糖和可溶性糖含量分别增加了7.30%～18.44%、14.91%～36.18%、22.52%～30.45%，淀粉含量下降了19.06%～35.70%。施用外源褪黑素显著提高了干旱胁迫下果糖、蔗糖和可溶性糖含量，降低淀粉含量，与D 处理相比，D+M 处理后25d 内果糖、蔗糖和可溶性糖含量分别增加了4.24%～8.36%、6.96%～20.12%、3.73%～15.93%，淀粉含量降低了9.41%～18.53%。复水后，D 和D+M处理的糖类物质含量均上升，其中D+M 处理果糖和蔗糖含量显著增加。因此，施用外源褪黑素处理在一定程度上可提高干旱胁迫下碳水化合物（果糖、蔗糖和可溶性糖）含量。

图6 干旱胁迫下外源褪黑素对红小豆糖类物质含量的影响Fig.6 Effects of exogenous melatonin on sugar contents of adzuki bean under drought stress

2.4 对产量构成因素的影响

如表2 所示，干旱胁迫降低了红小豆植株单株荚数、单株粒数、百粒重和单株粒重。与CK 相比，D 处理分别降低了13.89%、7.29%、4.82%和6.82%。施用外源褪黑素处理可提高干旱胁迫下单株荚数、单株粒数、单株粒重和百粒重，与D 相比，D+M处理下单株荚数、单株粒数、百粒重和单株粒重分别提高了2.14%、4.65%、0.36%和5.20%，可见外源褪黑素可防止干旱胁迫对产量构成因素的影响，最终避免减产。

表2 干旱胁迫条件下褪黑素对产量构成因素的影响Table 2 Effects of melatonin on yield components under drought stress

3 讨论

干旱胁迫下植物体内活性氧动态平衡被打破，产生过量ROS，导致膜脂过氧化，褪黑素通过提高抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性来清除过量的ROS，缓解干旱带来的氧化损伤[22-23]。本试验研究表明，干旱胁迫下红小豆叶片内电导率、、MDA 和H2O2含量增加，说明叶肉细胞内ROS过度积累使细胞膜受到干旱带来的损伤，褪黑素处理下的叶肉细胞内抗氧化酶活性增加，能清除MDA 和H2O2，维持细胞内动态平衡。在复水后干旱胁迫处理下，抗氧化酶活性有所提高但仍低于CK 处理，而褪黑素处理的抗氧化酶活性高于干旱处理，这有可能与褪黑素使细胞内维持更好的稳定性有关。在逆境下植物通过提高渗透调节物质的方式降低渗透势，维持细胞内渗透势平衡[24]，本试验中，红小豆在苗期受到干旱胁迫使叶肉细胞内渗透调节物质（Pro 和可溶性蛋白）含量增加，经褪黑素处理后使其进一步提高，维持细胞内渗透势平衡及细胞膜的完整性，从而提高红小豆对干旱环境的抵抗能力。

绿色植物吸收光能进行光合作用，叶绿素是光合作用的基础。干旱胁迫会抑制植物光合作用及营养生长，最终导致产量降低[25]。随干旱胁迫程度加剧，叶肉细胞内生理生化过程发生改变，阻碍叶绿素合成并加快其分解速度，使叶绿素含量迅速降低[6,26]。本试验表明，干旱胁迫显著抑制叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量，降低Pn、Tr、Gs和Ci，并随着干旱胁迫时间延长呈不断降低趋势。在干旱胁迫下喷施褪黑素后叶绿素含量上升，Pn、Tr和Ci显著升高，这可能是由于褪黑素改善了干旱下叶片气孔状态，促进叶片吸收更多光能。

Bakhshandeh 等[27]研究表明，干旱降低植物光合速率的同时，Fv/Fm和Fv/Fo也降低，光合作用的电子传递和光合原初反应过程减慢，导致光系统PSⅡ损伤。本研究发现，干旱胁迫下红小豆Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 随着干旱时间的延长而下降。褪黑素处理在干旱初期的作用不显著，但随着干旱程度加剧，其Fv/Fm、Fv/Fo和ΦPSⅡ较干旱胁迫仍维持较高的水平，这可能与褪黑素提高了干旱胁迫下红小豆叶片内叶绿素含量有关。研究发现，施用褪黑素可缓解叶绿素降解，提高Fv/Fm和ΦPSⅡ，促进玉米[28]和苹果[29]叶片的光合作用。

光合作用最终产物是碳水化合物，包括可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉，干旱胁迫使光合速率下降，光合产物产生速率减慢，碳水化合物的合成减慢[30]。本研究表明，褪黑素处理在干旱胁迫下提高了蔗糖和果糖含量，但淀粉含量却显著下降，可能是褪黑素降低了干旱胁迫下CO2同化过程中磷酸丙酮酶转化淀粉的能力。

苗期干旱胁迫抑制植株前期营养生长，进而造成作物产量下降，这是由于干旱胁迫抑制植物光合作用，碳水化合物合成受阻，同时植物体内产生过量ROS，细胞内动态平衡被打破，细胞膜受损，致使营养物质用于修复受损的机体，最终导致作物产量下降[31]。秦彬[32]研究表明，褪黑素对苗期干旱下绥农26 和黑农48 的株高、根长、单株荚数和单株粒重有促进作用，进而提高单株产量。本研究发现，随着干旱时间的延长，红小豆株高、茎粗和根长显著降低，长期干旱使红小豆单株荚数及单株粒数降低，单株粒重下降，进而百粒重减少。经过褪黑素处理的红小豆在干旱胁迫后其形态和产量较干旱胁迫处理均有所提高，这是由于褪黑素可提高红小豆的光合作用，提高抗氧化酶活性，清除ROS，缓解细胞内氧化损伤，促进碳水化合物的合成。

4 结论

干旱胁迫对苗期红小豆营养生长和收获期产量均起抑制作用。干旱胁迫下施用外源褪黑素可显著促进红小豆幼苗株高、叶面积和干物质积累，提高抗氧化酶活性，降低H2O2和MDA 含量，提高光合色素含量，改善光合和荧光参数，提高碳水化合物（蔗糖、果糖、可溶性糖）含量，最终可在一定程度上提高单株粒数，促进单株产量提高。