盐、碱胁迫下水稻种子萌发过程水分含量变化及对种子发芽影响的低场核磁检测研究

杨洪伟 张丽颖 李晓辉

（1 沈阳农业大学信息与电气工程学院，110866，辽宁沈阳；2 辽宁省农业信息化工程技术研究中心，110866，辽宁沈阳；3 辽宁省水稻研究所，110161，辽宁沈阳）

盐碱胁迫是影响农作物生长发育的主要非生物胁迫之一。根据第二次土壤普查可知，我国目前盐碱地面积约3.47×107hm2（5.2 亿亩）[1-2]，土地盐碱化严重阻碍了作物产量的提高，已经成为限制农业经济增长的重要因素。前人[3-4]研究表明，土壤盐化和碱化常常同时发生，但并非相同的非生物胁迫，二者对作物的伤害机理不同，作物在2 种胁迫下的响应机制也明显不同。因此，分别研究盐、碱胁迫下作物的响应机制对作物抗盐碱育种理论研究以及指导盐碱地区作物生产等具有重要意义。

水稻是我国的主要粮食作物，是全球约50%人口的主粮，全球30%以上的水田受到不同程度的盐碱化影响。水稻种子萌发期是成苗的关键期，极易受到盐碱胁迫的影响。因此，研究盐碱胁迫对种子萌发的影响对于水稻品种筛选具有重要意义。目前，前人[5-6]研究内容主要集中在混合盐碱胁迫对幼苗光合作用、矿质营养吸收、渗透调节及离子平衡和DNA 响应等方面，而对盐、碱胁迫下水稻种子萌发期水分变化的研究相对较少。

本文以水稻种子为研究对象，以低场核磁共振弛豫谱为技术手段，通过对比相同浓度NaCl 和NaHCO3胁迫处理下水稻种子萌发72h 过程中发芽指标的变化，分析在盐、碱胁迫下水稻种子萌发过程中的水分吸收及迁移规律，为抗盐碱水稻品种培育和筛选等方面的研究提供无损检测方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种选用耐盐碱性较强的盐粳48 和耐盐碱性较弱的辽星1，种子年份为2017 年，由辽宁省水稻研究所提供。核磁共振仪（型号：MiNiMR-60，磁场强度0.5T，上海纽迈电子科技有限公司），HPG-280BX 光照培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司），电热鼓风干燥箱GZX-9023MBE（上海博讯实业有限公司）。

化学试剂为NaCl、NaHCO3、NaClO 和蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 样本制备及处理 试验于2017-2018 年在北京国家农业信息化工程技术研究中心种子品质检测实验室进行，利用光照培养箱进行培养皿种子发芽试验。挑选籽粒饱满、大小一致的盐粳48（YJ48）、辽星1（LX1）种子各6000 粒，每组20 粒，共300 组，用于检测不同萌发时期种子核磁共振信号及鲜、干质量。另取2 个品种水稻种子样本各1000 粒，每组100 粒，用于种子发芽试验，以上每个处理均设置10 个重复。试验前，先对种子进行消毒处理，用3%NaClO 溶液浸泡种子3～5min。然后用蒸馏水冲洗3～5 次并用吸水纸吸干表面水分，均匀放置于铺有滤纸的培养皿中，在培养皿上书写对应标记。分别用蒸馏水、50、150mmol/L NaCl 及50、150mmol/L NaHCO3溶液对各组样本进行萌发处理，溶液用量以浸湿滤纸和种子为宜。将各组样本置于温度为27℃±1℃的HPG-280BX 光照培养箱中恒温培养，设置12h 光照和12h 无光照交替模式。每日更换滤纸和溶液，并记录各组样本发芽种子个数，直到第7 天为止。

式中，Gt为第t天发芽种子的数量，Dt为发芽天数。

1.2.2 水稻种子样本核磁共振信号采集 每次进行核磁共振试验前，都需要利用标准油样进行系统校准。首先执行软件的FID 序列，标定中心频率及90°、180°脉宽。然后，通过CPMG 序列检测样本的核磁共振信号，并将系统采集到的信号平均值导入核磁反演软件，以获得样本的横向弛豫时间（T2）反演谱，通过分析T2反演谱中代表种子样本中包含的束缚水和自由水核磁信号幅值，可以得出水稻种子萌发过程中水分组成及变化规律。

1.2.3 水稻种子样本鲜、干质量检测 将初始及分别萌发至6、24、48、72h 的水稻种子样本从培养皿中取出，首先用蒸馏水冲洗3～5 次，然后用吸水纸吸干其表面水分，称重，将各组质量平均值作为该组样本的鲜质量，然后将其放入干燥箱中，105℃杀青30min，80℃烘干至恒重，称重，将各组质量平均值作为该组样本干质量。

1.2.4 水稻种子样本湿基含水率NMR 检测方法的建立 核磁共振T2反演谱各个峰面积之和与被测样本中包含的氢质子数量成正比，而氢质子主要来源于样本中的水分子，因此每组样本的T2反演谱峰面积之和即代表了该组样本的水分含量多少。利用1.2.2 和1.2.3 检测的每组样本核磁信号幅值、鲜质量（Wf）和干质量（Wd），可以求出该组样本的湿基含水率（MC），计算公式为：

由此可以通过回归分析推导出单位质量种子样本核磁共振信号幅值与MC的线性回归方程。

1.3 数据处理

采用核磁反演软件和SPSS 19.0 进行试验数据分析与处理。文中所有数据均以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异达到显著水平。

2 结果与分析

2.1 NaCl 和NaHCO3胁迫处理对水稻种子发芽的影响

如表1 所示，NaCl 和NaHCO3胁迫对水稻种子的发芽指标影响显著（P＜0.05），与对照处理相比，2 个水稻品种胁迫条件下平均发芽时间延长，发芽指数和发芽率降低。与对照处理相比，盐粳48在50、150mmol/L NaCl 胁迫下，平均发芽时间分别延长了0.77 和1.00d，发芽指数分别降低了6.26%和8.45%，发芽率分别降低了0.00%和1.33%；在50、150mmol/L NaHCO3胁迫下，平均发芽时间分别延长了0.94 和1.14d，发芽指数分别降低了8.65%和10.39%，发芽率分别降低了2.50%和5.83%。辽星1 在50 和150mmol/L NaCl 胁迫下，平均发芽时间分别延长了0.55 和1.91d，发芽指数分别降低了4.52%和10.86%，发芽率分别降低了0.00%和4.67%；在50 和150mmol/L NaHCO3胁迫下，平均发芽时间分别延长了1.33 和2.03d，发芽指数分别降低了6.61%和11.07%，发芽率分别降低了1.33%和9.67%。

表1 NaCl 和NaHCO3 胁迫处理下水稻种子发芽指标对比Table 1 Comparison of germination indexes of rice seed under NaCl and NaHCO3 stress

2.2 NaCl 和NaHCO3 胁迫下束缚水和自由水核磁信号幅值的变化特征

图1～2 为反演频率值=10 000 时，不同浓度NaCl 和NaHCO3胁迫下盐粳48 种子0～72h 的T2反演谱对比图，横坐标表示T2，其值越小代表水分子与其他物质结合越紧密，纵坐标表示核磁信号强度。从图1～2 中可以看出，不同处理下，盐粳48种子不同萌发时间的反演谱均呈现出2 个波峰，由核磁原理可知，短弛豫时间（大峰）代表束缚水信号幅值，长弛豫时间（小峰）代表自由水信号幅值。随着萌发时间延长，束缚水和自由水信号幅值均逐渐增长，相比对照处理，同样胁迫处理下，胁迫浓度越大，束缚水和自由水信号幅值增长幅度越小。萌发相同时间后，相同浓度NaHCO3胁迫处理下束缚水和自由水增长幅度大于NaCl 胁迫处理。通过表2～3 可以看出，相比盐粳48，辽星1 种子在对照处理下，萌发6、24、48 和72h 后，束缚水核磁信号幅值增长率（A21）分别降低21.39%、26.73%、19.53%和18.73%，自由水核磁信号幅值增长率（A22）分别降低41.90%、81.27%、202.34%和351.78%；50mmol/L NaCl 胁迫处理下，A21分别降低18.06%、27.90%、20.78%和20.42%，A22分别降低31.87%、66.03%、168.03%和287.15%；150mmol/L NaCl胁迫处理下，A21分别降低17.17%、25.73%、13.10%和17.99%，A22分别降低35.18%、66.62%、50.32%和239.51%。50mmol/L NaHCO3胁迫处理下，A21分别降低19.44%、28.03%、23.23%和20.92%，A22分别降低35.57%、69.78%、180.00%和259.33%；150mmol/L NaHCO3胁迫处理下，A21分别降低19.06%、26.10%、12.55%和16.50%，A22分别降低36.98%、69.20%、206.86%和270.27%。

图1 NaCl 胁迫处理下单位质量盐粳48 种子T2 反演谱Fig.1 T2 inversion spectrum of per unit mass YJ48 seeds under NaCl stress

图2 NaHCO3 胁迫处理下单位质量盐粳48 种子T2 反演谱Fig.2 T2 inversion spectrum of per unit mass YJ48 seeds under NaHCO3 stress

表2 NaCl 和NaHCO3 胁迫下单位质量盐粳48 种子核磁共振信号幅值（A21 and A22）Table 2 NMR signal amplitude(A21 and A22)per unit mass YJ48 under NaCl and NaHCO3 stress

表3 NaCl 和NaHCO3 胁迫下单位质量辽星1 种子核磁共振信号幅值A21 and A22Table 3 NMR signal amplitude(A21 and A22)per unit mass LX1 under NaCl and NaHCO3 stress

2.3 NaCl 和NaHCO3 胁迫对萌发过程水稻种子核磁信号幅值的影响

通过表2～3 数据发现，在对照处理和不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下，2 个品种在0～72h 萌发过程中，核磁信号幅值（A21，A22）均极显著增长（P＜0.01），因核磁信号幅值可以代表种子中相对水分含量，可知水稻种子萌发过程中水分逐渐增长。以盐粳48 为例，相比初始状态，萌发6、24、48、72h 后，对照处理下，核磁信号幅值依次增长了71.83%、102.20%、125.17%和146.10%。50mmol/L NaCl 胁迫处理下，核磁信号幅值依次增长了66.22%、101.54%、124.95%和144.04%。150mmol/L NaCl 胁迫处理下，核磁信号幅值依次增长了65.88%、100.39%、117.75%和124.77%。50mmol/L NaHCO3胁迫处理下，核磁信号幅值依次增长了67.85%、102.16%、125.12%和145.56%。150mmol/L NaHCO3胁迫处理下，核磁信号幅值依次增长了67.59%、101.04%、119.01%和133.27%。

2.4 NaCl、NaHCO3 胁迫对2 个品种核磁信号幅值影响的比较

NaCl 和NaHCO3胁迫处理下，2 个品种种子萌发72h 过程中核磁信号幅值不断增长，相比对照处理，核磁信号幅值增长幅度显著降低（P＜0.05），但萌发相同时间后，NaHCO3胁迫处理下核磁信号幅值增长幅度均大于NaCl 胁迫处理（图3a～d）。以盐粳48 为例，由表2 可知，50 和150mmol/L 胁迫下，萌发6h 后，NaHCO3处理比NaCl 处理核磁信号幅值分别提高1.71%和1.63%。萌发24h 后，NaHCO3处理比NaCl 处理核磁信号幅值分别提高0.62%和0.65%。萌发48h 后，NaHCO3处理比NaCl处理核磁信号幅值分别提高0.17%和1.26%。萌发72h 后，NaHCO3处理比NaCl 处理核磁信号幅值分别提高1.52%和8.50%。

图3 NaCl 和NaHCO3 胁迫下单位质量盐粳48 种子萌发6、24、48、72h 后核磁信号幅值对比Fig.3 Comparison of NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds after germination 6,24,48,72h under NaCl and NaHCO3 stress

2.5 NaCl、NaHCO3 胁迫下核磁信号幅值与水稻种子湿基含水率的关系

在对照和不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫处理下，对2 个品种0～72h 萌发过程核磁信号幅值的检测可以看出，核磁信号幅值不断增长，这与通过烘干称重法得出的MC具有一致的增长趋势。利用数据统计分析软件进行回归分析，NaCl 和NaHCO3胁迫处理下，2 个品种单位质量核磁信号幅值与MC具有较为一致的线性关系（图4～5）。以盐粳48 为例，在NaCl 胁迫处理下，回归方程为y=218.05x+4235（R2=0.9675），对回归方程进行显著性检验，F=3815.27，P＜0.05，达到显著水平。在NaHCO3胁迫处理下，回归方程为y=229.56x+4185.4（R2=0.9556），对回归方程进行显著性检验，F=2754.11，P＜0.05，同样达到显著水平。

图4 NaCl 胁迫下单位质量盐粳48 种子核磁信号幅值与MC 回归分析Fig.4 Regression between MC and NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds under NaCl stress

图5 NaHCO3胁迫下单位质量盐粳48 种子核磁信号幅值与MC 回归分析Fig.5 Regression between MC and NMR signal amplitude of per unit mass YJ48 seeds under NaHCO3 stress

3 讨论

3.1 胁迫条件下水稻种子萌发过程中水分含量变化对种子发芽的影响

NaCl 和NaHCO3胁迫下，2 个品种种子萌发相同时间后，核磁信号幅值增加幅度均小于对照处理，可见，盐、碱胁迫抑制了水稻种子对水分的吸收，溶液浓度越高，抑制作用越强。这可能是因为胁迫处理下，溶液中离子浓度升高，渗透势增强，因而水势降低，导致进入种子内的水分降低，水分降低引起种子内的代谢缓慢，抑制了种子的萌发过程，同时毛细管的面积减少也使吸附的水分含量减少，盐、碱浓度越高渗透势越强，水势越低，代谢活动越缓慢，需水量越少[7-8]。

NaCl 和NaHCO3胁迫下，2 个品种发芽率均显著降低（P＜0.05），说明盐、碱胁迫均抑制了种子的萌发过程，破坏了种子萌发正常的生理状态。NaHCO3胁迫下水稻种子发芽率降低幅度大于NaCl 胁迫，说明碱胁迫对水稻种子的危害作用大于盐胁迫[9-10]，但NaHCO3胁迫下核磁信号幅值降低幅度小于NaCl 胁迫，说明碱胁迫对水稻种子萌发的危害作用大于盐胁迫并非吸水量降低所致，可能是除了渗透胁迫和离子毒害之外，碱胁迫比盐胁迫具有更高的pH[11-12]。

3.2 胁迫条件下水稻种子萌发过程中水分含量变化

在对照处理、NaCl 和NaHCO3胁迫下，2 个品种在0～72h萌发过程中，核磁信号幅值均显著增长，可知水稻种子萌发过程中水分逐渐增长。这是因为种子必须吸收足够的水分萌发过程才能进行，前24h 属于种子萌发的吸胀吸水阶段，与种子代谢无关，吸水速度较快。快速吸水后，原生质的水合程度趋向饱和，细胞膨压增加，阻碍了细胞进一步吸水，因而24h 后吸水速度变慢。随着细胞水合程度增加，酶促反应与呼吸作用增强，种子内的贮藏物质开始分解变成可溶性化合物，这些可溶性分解产物被输送到胚胎中，这一方面为胚胎发育提供了营养，另一方面也降低了胚胎细胞水势，提高了胚胎细胞的吸水能力。在储存养分转化和运输的基础上，大量合成胚根和胚芽中核酸和蛋白质等原生质体的成分，增强了细胞的吸水性，进入生长和吸收阶段。因而种子萌发过程中，核磁信号幅值不断增长[13-14]。

在对照处理、NaCl 和NaHCO3胁迫下，萌发相同时间后，盐粳48 的束缚水、自由水及总水分含量增长率均高于辽星1。由发芽率试验可知，盐粳48 的耐盐碱性高于辽星1，可能是耐盐碱性高的水稻品种在同样处理下吸水率高于耐盐碱性弱的品种[15-16]。

3.3 低场核磁检测技术测定种子含水量的可行性

由低场核磁共振原理可知，T2与氢质子的类型以及系统所处的物理和化学环境密切相关。因此，分析待测样品的T2就可以分析出水分子与样品中其他物质的结合程度[17-19]。T2值越小，代表水分子与其他物质结合程度越紧密，因此，可以根据T2分析出待测样品中所含水分的相态。

当核磁共振反演频率值为10 000 时，在对照处理、NaCl 和NaHCO3胁迫下，盐粳48 和辽星1 种子0～72hT2反演谱均呈现出2 个波峰，其包含峰面积越大表示氢质子数越多，含水量越大[20-21]，由核磁共振原理可知，萌发期水稻种子中包含束缚水与自由水2 个相态水分，说明利用低场核磁共振弛豫谱能直观揭示出种子萌发过程中不同相态水分及转运规律。

4 结论

在对照处理、NaCl 和NaHCO3胁迫处理下，利用核磁共振技术检测盐粳48 和辽星1 种子萌发过程水分变化规律与利用传统的烘干称重法得出的水分变化规律是一致的，MC和核磁共振T2总幅值均具有一致的线性关系，说明利用核磁共振技术检测盐、碱胁迫下水稻种子的水分含量是合理可靠的。试验为作物抗盐碱育种研究及指导盐碱地区作物生产提供理论支持和数据参考，同时为逆境下的作物水分含量及转运规律无损检测提供了一种新的方法。