巨噬细胞来源的外泌体对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响*

韩 笑,王雪莲

复旦大学附属中山医院青浦分院血液科,上海 201700

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最为常见的一种类型,每年约有15万例新发病例,约占所有非霍奇金淋巴瘤的30%,DLBCL具有高度侵袭性,发病后可累及全身多个脏器。目前,利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松方案已经成为治疗DLBCL的标准一线化疗方案,大大提高了患者的生存率,由于该病异质性大,仍有近1/3的患者容易复发或者产生耐药性。在过去的几十年里,基于临床病理学特征的预后因子,包括AnnArbor分期、国际预后指数(IPI)等被广泛应用于评价DLBCL患者的预后,然而,IPI和治疗方案一致的患者却有着不同的预后[1]。外泌体是由多种细胞分泌的小细胞外囊泡,在人体体液中广泛分布,不同组织来源的外泌体携带的核酸、蛋白质和脂质也不完全相同。目前,关于外泌体的研究主要集中在肿瘤血管生成、免疫、肿瘤微环境等方面,与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移有一定相关性[2]。肿瘤细胞来源的外泌体具有调控巨噬细胞的功能,反之,巨噬细胞来源的外泌体亦具有调控肿瘤细胞生物学行为的作用;肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以通过与外泌体互相作用,在肿瘤的增殖、侵袭、转移等方面发挥重要作用。目前有研究主要集中在肝癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等[3],而巨噬细胞来源的外泌体对DLBCL的影响及机制尚不清楚,探寻新的DLBCL疾病预后标志物及机制可为深入研究DLBCL的发病机制及防治提供新思路。本研究主要探讨巨噬细胞来源的外泌体对人DLBCL细胞系U2932细胞生物学行为的影响,为进一步研究DLBCL的发病机制提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 巨噬细胞株(RAW264.7细胞)、人DLBCL细胞系U2932细胞均购自中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂 RPMI1640购自美国Corning公司;青/链霉素购自美国Gibco公司;Dil染料购自北京索莱宝科技公司;CCK-8试剂盒、结晶紫染液均购自上海碧云天生物科技公司;外泌体染色滤柱购自上海碧云天生物科技公司;人源重组巨噬细胞集落刺激因子购自美国ThermoFisher公司;胎牛血清购自天根生化科技有限公司。

1.3方法

1.3.1体外巨噬细胞极化模型构建 将RAW264.7细胞株用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养,当RAW264.7细胞株达到2×106/mL时,将细胞悬液放入离心管中离心处理,当细胞状态良好且悬浮细胞总量达107个时,接种于12 孔板中,用白细胞介素(IL)-4和IL-13慢病毒表达载体感染细胞,12 h后去上清液,更换培养基,72 h 后在培养液中加入嘌呤霉素(1 μg/mL)继续培养7 d,在药物筛选下最后存活的细胞为稳定株,即为M2型巨噬细胞,然后收集用于后续试验。

1.3.2外泌体提取 取标本15 mL放入离心管中,加入磷酸盐缓冲液(PBS),配平后以300×g、4 ℃离心10 min,取上清液转移到新的15 mL离心管中,配平后以2 000×g、4 ℃离心10 min,转移至超速离心机配套的离心管中,配平所收集的超速离心机配套离心管中的上清液后以10 000×g、4 ℃离心30 min,取上清液转移至超速离心机配套的离心管中;配平所收集的超速离心机配套离心管中的上清液后以100 000×g、4 ℃离心70 min,取透明沉淀,并用250、150 μL的PBS重悬,所得即为外泌体溶液,按检测要求分装后于-80 ℃冰箱保存待检。

1.3.3透射电镜检测外泌体形态 将50 μL外泌体标本滴在200目的铜网上,室温下孵育5 min,然后用滤纸吸去铜网边缘多余的液体,接着用1%磷钨酸负染色1 min,用蒸馏水冲洗铜网1～2次,再用滤纸吸去多余的液体,干燥后,用TEM-1400plus透射电镜在80 kV下观察铜网。

1.3.4纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测外泌体水平和粒径 将外泌体标本的水平用PBS稀释,采用ZetaViewPMX110仪器进行检测,并用ZetaView8.04.02软件进行数据分析。

1.3.5免疫荧光法检测外泌体传递 将适量Dil染料加入外泌体中,避光染色20 min,经外泌体染色滤柱去除多余的染料。以加外泌体的人DLBCL细胞作为外泌体组,以未加外泌体的人DLBCL细胞作为对照组,处理后的外泌体加入DLBCL细胞中培养,在37 ℃培养箱中培养24 h后,用4%甲醛固定并采用荧光显微镜观察两组人DLBCL细胞和RAW264.7细胞中的荧光强度。

1.3.6CCK-8法检测U2932细胞增殖 取人DLBCL细胞与M2型巨噬细胞来源的外泌体共孵育24 h后取计数板,进行细胞计数,将1.5×104个/孔接种于96孔板中,以加外泌体的人DLBCL细胞作为外泌体组,以未加外泌体的人DLBCL细胞作为对照组,每组设置为5个复孔,将细胞放入培养箱中培养,分别在每孔0、24、48、72 h加入10 μL CCK溶液,孵育2 h,采用酶标仪于450 nm处测定吸光度(A)值。

1.3.7细胞划痕试验检测U2932细胞迁移 取人DLBCL细胞与M2型巨噬细胞来源的外泌体共孵育24 h后计数,接种于6孔板中,在直尺辅助下,采用枪头划直线,PBS清洗,培养48 h。以加外泌体的人DLBCL细胞作为外泌体组,以未加外泌体的DLBCL细胞作为对照组,显微镜下观察6孔板中U2932细胞划痕,分别在0、48 h的时间点内随机选择3个视野拍照,计算迁移率。

1.3.8Transwell法检测U2932细胞侵袭 取人DLBCL细胞与M2型巨噬细胞来源的外泌体共孵育24 h后计数,取2×105个DLBCL细胞均匀平铺到8 μm PET小室中,并加入200 μL不含胎牛血清(FBS)的培养基,将小室放置于24孔板中,下室加入600 μL含FBS的培养基,然后置于37 ℃培养箱中培养18 h,随后将小室取出并用PBS清洗,用棉签小心将小室内的细胞擦掉,PBS洗3次,接着将小室浸没于4%甲醛中固定20 min,固定后室温晾干并放于结晶紫染液中10 min,PBS冲洗3次后使用显微镜观察并计数,以加外泌体的人DLBCL细胞作为外泌体组,以未加外泌体的DLBCL细胞作为对照。

1.3.9流式细胞术检测U2932细胞凋亡 取人DLBCL细胞与M2型巨噬细胞来源的外泌体共孵育接种于培养皿中。以加外泌体的人DLBCL细胞作为外泌体组,以未加外泌体的DLBCL细胞作为对照组。采用离子水将10×BindingBuffer稀释成1×BindingBuffer后,将各组以1 200 r/min离心5 min,PBS重悬,1 200 r/min离心5 min,重悬细胞,离心后加入BindingBuffer和AnnexinV-FITC混匀,孵育15 min,采用流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1外泌体浓度和粒径 通过透射电镜检测发现,所得的外泌体呈圆形,具有比较明显的膜结构。NTA检测结果显示,外泌体水平为(5.27±0.36)×1010particles/mL,平均粒径为121.69 nm,单峰,呈正态分布,直径50～150 nm,其密度约为(1.15±0.03)g/mL。

2.2外泌体传递 免疫荧光法检测结果显示,外泌体组在人DLBCL细胞和RAW264.7细胞中的荧光强度分别为22.78±5.42和32.96±4.93,对照组人DLBCL细胞和RAW264.7细胞中的荧光强度分别为9.03±1.46和8.97±1.35,与对照组比较,外泌体组在人DLBCL细胞和巨噬细胞株RAW264.7细胞中的传递均明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注:与对照组比较,*P<0.05。

2.3人DLBCL细胞系U2932细胞增殖能力 CCK-8 法检测结果显示,外泌体组在0、24、48、72 h的A值分别为0.44±0.07、0.63±0.13、0.87±0.21、0.96±0.19,对照组分别为0.42±0.05、0.49±0.08、0.53±0.11、0.61±0.15,外泌体组人DLBCL细胞系U2932细胞增殖能力均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 两组人DLBCL细胞系U2932细胞增殖能力比较

2.4人DLBCL细胞系U2932细胞迁移和侵袭能力 细胞划痕试验和Transwell法检测结果显示,外泌体组人DLBCL细胞系U2932细胞迁移率为(78.92±11.45)%,细胞侵袭个数为(218.54±30.57)个;对照组人DLBCL细胞系U2932细胞迁移率为(47.32±8.19)%,细胞侵袭个数为(89.21±13.84)个。外泌体组细胞迁移率和细胞侵袭个数均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.5人DLBCL细胞系U2932细胞凋亡能力 流式细胞术检测结果显示,外泌体组凋亡率为(4.87±1.07)%,对照组为(13.16±4.63)%,外泌体组凋亡率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注:A为对照组细胞凋亡;B为外泌体组细胞凋亡。与对照组比较,*P<0.05。

3 讨 论

DLBCL是淋巴瘤中侵袭性较强的一类,无论是在生物学特征还是在临床上均具有很大的异质性[4]。尽管以抗CD20的Rituximab为代表的治疗使DLBCL患者的生存得到明显改善,但是仍有部分患者完全缓解后容易在疾病早期复发或者出现耐药,对患者预后的预测仍然困难[5]。外泌体属于细胞外囊泡,起源于细胞内的多泡内体,通过内向出芽作用,并包裹特异分选的核酸、蛋白、脂质等生物大分子产生多个管腔囊泡,外泌体随体液流动到达靶细胞,发挥其相应的生物学作用。巨噬细胞是一群具有高度可塑性的细胞,是固有免疫系统的重要组成部分,根据环境的变化,巨噬细胞可以快速作出反映,表现出不同的表型和功能,在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。M1型巨噬细胞一般被认为具有抗肿瘤作用,而M2型巨噬细胞通常被认为是肿瘤相关巨噬细胞,可以通过血管生成和淋巴管生成调节、免疫抑制、缺氧诱导等促进肿瘤发生、增殖、转移[6]。巨噬细胞来源的外泌体参与很多重要的病理、生理过程。XU等[7]通过研究发现,肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体通过将lncMMPA 转移至肿瘤细胞并激活糖酵解途径促进肝细胞癌的恶性发展;WEI等[8]研究发现,M2型巨噬细胞来源的外泌体通过传递miR-942 促进肺腺癌进展。人们也越来越关注肿瘤或巨噬细胞来源的外泌体的基本特征及其之间的相互作用关系,这些外泌体会导致治疗期间的癌症进展和耐药性,及其潜在的临床应用前景。目前,关于巨噬细胞来源的外泌体在DLBCL中的作用和机制尚不明确,因此,揭示巨噬细胞来源的外泌体与DLBCL发病之间的关系,探讨巨噬细胞来源的外泌体对DLBCL细胞生物学行为的影响及相关发病机制就显得非常重要。

本研究采用超速离心法提取外泌体,得到50～150 nm大小的囊泡,分离囊泡的纯度较好。同时采用免疫荧光法检测外泌体的传递情况,结果显示,外泌体组在人DLBCL细胞和巨噬细胞株RAW264.7细胞中的传递均明显增多。为了验证M2型巨噬细胞来源的外泌体在人DLBCL细胞中增殖、侵袭、迁移和凋亡的作用,本研究让人DLBCL细胞与M2型巨噬细胞来源的外泌体共孵育24 h,以未加外泌体的人DLBCL细胞作为对照,通过各项试验研究结果表明,加入外泌体的人DLBCL细胞系U2932细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显高于对照组,而凋亡能力明显低于对照组。上述结果表明,M2型巨噬细胞来源的外泌体具有调控人DLBCL细胞系U2932细胞的生物学功能,能够促进人DLBCL细胞系U2932细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。癌症的进展与免疫细胞活性的失调密切相关,肿瘤相关外泌体被认为是癌症和免疫细胞之间交换物质的媒介,M2型肿瘤相关巨噬细胞具有促进肿瘤进展的功能。LING等[9]研究发现,DLBCL分泌的外泌体可以诱导巨噬细胞转化为肿瘤M2样表型,并且阻断药物诱导的DLBCL细胞凋亡,不同DLBCL衍生的外泌体可以通过STAT3信号改变巨噬细胞的表型,STAT3信号上调致癌基因和M2样表型巨噬细胞经典标志物的表达,DLBCL衍生的外泌体可以促使巨噬细胞极化为促生长的M2样表型的表达。此外,LIU等[10]研究发现,从DLBCL释放的细胞外囊泡增强了巨噬细胞的M2极化效应,DLBCL衍生的细胞外囊泡通过增加PGC-1β蛋白的表达来调节巨噬细胞的代谢,重编程促进肿瘤进展的巨噬细胞表型,从而促进肿瘤进展。LIU等[10]研究表明,DLBCL释放的外泌体促进巨噬细胞极化成M2型,M2型巨噬细胞释放的外泌体又进一步促进DLBCL进展,也进一步印证了本研究的结论,即M2型巨噬细胞来源的外泌体能够促进人DLBCL细胞系U2932细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。

综上所述,巨噬细胞来源的外泌体能够促进人DLBCL细胞系U2932细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。本研究未进行巨噬细胞来源的外泌体对人DLBCL细胞系U2932细胞促进作用的具体机制研究,但通过对DLBCL生物学行为的观察,为进一步研究巨噬细胞来源的外泌体在DLBCL发生和发展中的相关机制提供了一定的理论基础。