微囊藻毒素检测用电化学生物传感器的研究

古瑞琴,付会兵,黄 清,赵雨农,刘 欢

(1.华中科技大学集成电路学院,武汉光电国家研究中心,湖北光谷实验室,湖北武汉 430074;2.郑州炜盛电子科技有限公司,河南郑州 450001)

0 引言

微囊藻毒素(MC)是在富营养化的水体环境中由微囊藻产生的具有生物活性的单环多肽类化合物,结构式如图1(a)所示,结构中X、Y为高度可变氨基酸[1],可形成不同的异构体,目前已发现270多种[2],其中LR型微囊藻毒素(MC-LR)是众多异构体中对人体和动物危害最大的藻类毒素之一[3-5]。MC-LR作为一种以动物肝脏为作用靶器官的藻类毒素,能够抑制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变,是世界各国广泛存在且危害极大的一种蓝藻毒素[6]。微囊藻毒素与肠、胃等消化道器官肿瘤也存在一定关联[7]。

(a)微囊藻毒素结构式

鉴于微囊藻毒素的危害,国际卫生组织(WHO)建议将饮用水中的MC-LR的质量浓度控制在1.0 μg/L以内,GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》也规定饮用水中的MC-LR限值为1.0 μg/L。用于微囊藻毒素检测的生物传感器具有检测速度快的优点,有助于实时保障饮用水的安全,得到了广泛研究[8-9]。

检测微囊藻毒素的电化学生物传感器一般选取对微囊藻毒素具有特异性反应活性的材料修饰电极,利用一定条件下的电化学反应产生的电信号来判断微囊藻毒素质量浓度。目前,基于重组蛋白修饰电极的电化学生物传感器对微囊藻毒素的检出限低至0.93 μg/L[10],具有检测成本低和操作简便的特点。

利用各类功能材料对电极进行修饰以进一步提高灵敏度,是电化学传感器领域的研究热点。其中,基于低维半导体材料修饰电极的电化学传感器在重金属离子[11-12]、蛋白生物大分子[13-14]的快速检测中表现出了高灵敏度、高特异性的特点。低维半导体灵活可调的化学活性和导电特性使其成为一种优良的化学电极修饰材料。本文采用氧化锡胶体量子线修饰金电极,通过在氧化锡薄膜表面进一步包被MC-LR抗体,制备出对MC-LR抗原具有较高灵敏度和特异性的电化学生物传感器。研究结果表明:氧化锡修饰提高了微囊藻毒素抗体在电极表面的富集能力,同时具有促进电荷传输的作用。

1 实验

1.1 试剂与仪器

试剂:四氯化锡,油胺,甲苯、丙酮、乙醇、铁氰化钾、亚铁氰化钾、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠,油酸;牛血清蛋白,微囊藻毒素MC-LR抗原,微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体。

仪器:CHI660E型电化学工作站,透射电子显微镜,场发射扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱仪。

1.2 传感器制备

1.2.1 电化学平面电极制备

在氧化铝陶瓷衬底上丝网印刷金电极浆料,600 ℃烧结0.5 h后形成包括工作电极(WE)、对电极(CE)和参比电极(RE)的平面三电极体系。电极图形如图1(b)左图所示,其中,氧化铝陶瓷衬底尺寸为27 mm×9.6 mm×0.64 mm,工作电极直径为3 mm。

1.2.2 二氧化锡量子线合成

向烧杯中按比例加入油酸、油胺、SnCl4·5H2O,超声振荡1 h使其完全溶解并混合均匀,然后向混合液中加入一定量乙醇混合均匀,转入高压反应釜中,在180 ℃条件下反应8 h,取出迅速用水冷却,用甲苯与乙醇比为1:3的混合液清洗得到的产物,重复3次后使用一定量的甲苯溶解,得到质量浓度为20 mg/mL的胶体状SnO2量子线溶液。

1.2.3 电极修饰

取上述溶液滴涂至工作电极表面,自然晾干,重复3次形成一定厚度的SnO2薄膜。再取10 μL质量浓度为30 ng/mL的微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体溶液滴涂至SnO2薄膜上,于25 ℃条件下孵育1.5 h,然后用1 mL浓度为0.01 mol/L的pH值为7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液(PBS)冲洗薄膜表面,自然晾干后即完成抗体包被。为了减少非特异性结合,在上述工作电极表面继续滴涂10 μL质量浓度为5 μg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液,25 ℃封闭处理1 h,钝化未结合抗体的SnO2表面活性位点,降低非特异吸附对测试结果的影响。最后,使用浓度为0.01 mol/L的pH值为7.4的PBS冲洗薄膜表面,得到如图1(b)右图所示的Au/SnO2/MC-LR-Antibody/BSA电化学生物传感器,用于检测MC-LR抗原(MC-LR-Antigen)。

1.3 传感器性能测试

1.3.1 电化学性能测试

在传感器三电极表面滴加一定量的铁氰化钾/亚铁氰化钾/氯化钾([(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl)的PBS溶液作为氧化还原介体溶液,进行电化学阻抗谱(EIS)测试,用于分析电极的电化学特性。

1.3.2 MC-LR抗原检测性能测试

采用差分脉冲伏安(DPV)方法测试传感器对MC-LR抗原的检测性能。首先配制MC-LR抗原溶液,质量浓度分别为1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL。取上述不同质量浓度的MC-LR抗原溶液180 μL分别滴加至三电极表面,静置5 min,然后用移液枪吸走待测液,并用1 mL浓度为0.01 mol/L的pH值为7.4的PBS溶液冲洗电极表面,洗掉未被牢固吸附的待测物;最后在电极表面滴加180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液进行DPV测试,研究峰值电流随MC-LR抗原质量浓度的变化规律。

1.3.3 抗干扰性能测试

重点考察传感器对Hg2+、Pb2+、Cd2+等重金属离子的抗干扰能力。分别将180 μL浓度为5 ng/mL的MC-LR抗原溶液、浓度为10-6mol/L的Hg2+、Pb2+和Cd2+标准溶液滴于三电极表面,静置5 min后用移液枪吸走待测液,用PBS缓冲溶液冲洗电极表面后,滴加180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液进行DPV测试。

2 结果与讨论

2.1 微观表征

合成产物的XRD图谱如图2(a)所示,通过与标准X射线衍射卡(JCPDS 41-1445)比较,在26°、34°、52°及65°的衍射峰分别对应SnO2的(110)、(101)、(211)和(112)晶面,为立方金红石结构;图2(b)所示的TEM图也表明产物结晶性良好,形成平均线径为3 nm左右的纳米线。氧化锡的激子波尔半径为2.7 nm,得到的SnO2线径小于其激子波尔半径的2倍,具有量子线材料特有的尺寸效应、量子限域效应等[15]。图2(c)和图2(d)分别是SnO2/MC-LR-Antibody薄膜在BSA封闭前后的SEM图。可以看到,电极表面SnO2量子线薄膜在完成微囊藻毒素抗体包被后,具有一定裂缝,与薄膜制备过程中溶剂挥发产生的应力有关;BSA封闭后,薄膜表面更为均匀平整,表明BSA封闭有填补薄膜裂缝的效果,有助于固液和固固界面的电荷转移。

SnO2与MC-LR抗体的结合界面对传感器性能有重要影响。SnO2量子线材料表面的长链油酸配体作为金属配位基团(Sn-O)及亲溶剂基团,使量子线以胶体形式稳定分散,可通过简便的溶液法制备出高质量薄膜。同时,胶体纳米材料表面的配体具有可置换性[16],在包被抗体蛋白质的过程中,可通过配体置换形成良好的偶联,无需借助偶联剂即可实现对抗体蛋白质的标记[13]。

本文采用傅里叶红外光谱仪分析SnO2与MC-LR抗体以及抗体抗原之间的结合情况,分别测试了不同阶段的电极样品,结果如图3所示。从图3可以看出,SnO2量子线薄膜在波数为2 829～3 100 cm-1位置的C-H伸缩振动峰[17-18]和1 650 cm-1处的C=O羰基特征峰,源自SnO2薄膜表面的油酸和油胺配体[19-20]。继续包被MC-LR抗体后,SnO2薄膜表面的官能团发生变化,2 829～3 100 cm-1处的C-H峰出现了偏移和一定程度的增强,可能是由于蛋白里C-H含量更高的原因。且1 650 cm-1处的C=O峰强度增强并且位置略微向短波方向移动,说明抗体蛋白与SnO2表面的配体结合导致表面基团发生变化,提示抗体蛋白通过配体置换与SnO2成功交联。BSA封闭后,在波数为1 650 cm-1处出现了BSA的i带酰胺特征峰,表明BSA稳定结合于电极表面。继续滴加MC-LR抗原后的电极样品,由于MC-LR抗原含有共轭双键(C=C)及特征官能团胍基,因此在1 540 cm-1出现共轭双键的伸缩振动峰[21]。上述结果表明,SnO2及各修饰材料在电极表面能够很好的附着。

图3 不同电极样品的FTIR测试图谱

2.2 电化学特性分析

在平面三电极表面滴加一定量的[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl溶液作为氧化还原介体溶液,分别进行DPV和EIS测试,用于分析电极的电化学特性。

首先对比测试了Au电极直接复合MC-LR抗体(Au/MC-LR)和先在Au电极上修饰SnO2后复合MC-LR抗体(Au/SnO2/MC-LR-Antibody)的电极在[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl溶液中的电化学阻抗谱和DPV曲线,由电化学阻抗谱和DPV曲线分别计算电极的Rct和DPV峰电流,结果如图4所示。从图4可以看出,修饰SnO2后,电极的Rct变小,电子导电能力增强,这可能和SnO2量子点的量子隧道效应有关。并且修饰SnO2后DPV曲线的峰电流增大,说明电极对离子的富集能力增强、电极活性增加。

(a)SnO2修饰前后的Rct的大小对比

电极的电子传输能力是影响传感器检测灵敏度的重要因素,所以采用电化学阻抗谱(EIS)测试表面逐层修饰不同材料后的电极样品电化学特性,如图5(a)所示,按照5(a)中插图的等效电路分析电化学体系的电阻特性和电容特性,研究电极的电子传输能力。半圆部分代表Rct的大小,反映电极的电子传输能力,结果表明:随着表面修饰材料依次增加,Rct先增大后减小;直线部分的斜率代表Cd的大小,反映双电层对电化学反应的影响,不同样品的EIS曲线直线部分基本保持平行,可能是由于电极所在液体环境离子浓度相对较低,所以Cd变化不大。

(a)依次修饰不同材料后的电化学阻抗图(插图部分为该电化学体系的等效电路)

图5(b)进一步对比了根据EIS曲线提取的各电极样品Rct的大小。金电极上修饰SnO2后,Rct显著增大,表明电子传输能力下降,但在MC-LR抗体包被和BSA封闭之后,Rct有所降低,原因可能在于蛋白分子的高活性促进了Fe3+/Fe2+离子在电极表面的吸附,并在一定的电压条件下发生电子转移,因此抗体蛋白可促进电子传输,表现为Rct降低。

2.3 电极修饰工艺条件优化

影响化学修饰电极对MC-LR抗原检测结果的因素很多,本文按照表1所示条件分别研究MC-LR抗体的质量浓度及其包被时间、封闭剂BSA的质量浓度及封闭时间对传感器性能的影响,如图6所示。采用电化学工作站测试传感器在[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液中的DPV曲线,通过DPV曲线中峰电流的大小判断电极的最佳修饰条件。峰电流越大,电极的导电能力越好,通过优化电极修饰条件提升电极的导电能力。

表1 电极修饰优化参数

(a)不同抗体质量浓度的DPV曲线

图6(a)是不同质量浓度抗体对应的电极样品在180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液进行DPV测试的结果,插图是提取的DPV曲线的峰电流柱状图。从图6(a)中可以看出,在其他工艺参数不变的前提下,随着抗体质量浓度增加,DPV峰电流先增大后减小,当所修饰的抗体质量浓度为30 ng/mL时,峰电流最大。原因可能是随着所修饰抗体质量浓度的增加,吸附在SnO2表面的抗体数量逐渐增加,抗体对Fe3+/Fe2+的吸附量逐渐增多,氧化还原反应产生的电流也逐渐增大;随着抗体浓度的继续增加并在电极表面造成过剩积聚,阻碍了吸附在电极表面的Fe3+/Fe2+产生的电信号在SnO2/Au导电层传导,导致峰电流减小。

进一步研究抗体包被时间对电极DPV峰电流的影响,如图6(b)所示,随着包被时间的延长,峰电流也表现出先增大后减小的趋势,在抗体质量浓度为30 ng/mL时,修饰时间为1.5 h时峰电流最大。这可能是因为在浓度梯度的作用下,MC-LR抗体逐渐与SnO2结合,当电极表面包被的抗体达到饱和之后,随着修饰时间的延长,多余的抗体在电极积聚,不利于电荷传输。

图6(c)是不同质量浓度BSA封闭条件下的DPV对比,从结果可以看出,在实验范围内,随着BSA质量浓度的增大,峰值电流逐渐减小,说明BSA蛋白质有阻碍电极表面电荷传输的作用,在达到阻碍非特异性结合封闭效果的前提下,BSA的量可以尽量小,本文中BSA最优质量浓度为5 μg/mL。

进一步研究了BSA封闭时间的影响,从图6(d)可以看出,在实验范围内,封闭时间对峰电流的影响无明显规律,按照峰电流尽可能大、修饰时间尽可能短的原则,优选修饰时间为1 h。

通过上述单因素试验,确定电极修饰最佳工艺条件为:MC-LR抗体质量浓度为30 ng/mL,修饰时间为1.5 h;BSA质量浓度为5 μg/mL,封闭时间为1 h。

2.4 传感器对MC-LR的检测性能

差分脉冲伏安法作为一种常用的电化学分析方法,可显著降低背景电流的影响,保证检测的高灵敏度和高分辨率,适用于低质量浓度生物化学分子的检测。按照2.3优化的条件制备电化学生物传感器,并分别对浓度范围在1 pg/mL～10 ng/mL的6种质量浓度MC-LR抗原溶液进行DPV测试,结果如图7(a)所示。

(a)修饰电极对不同质量浓度MC-LR抗原的DPV曲线

从图7(a)中可以看出在不同质量浓度的MC-LR抗原溶液中,传感器均有明显的DPV氧化峰电流。在PBS溶液中,电极在0 V左右存在明显的溶出峰,可能是SnO2在0 V左右发生氧化还原反应所致。随着MC-LR质量浓度的升高,MC-LR抗体与抗原进行特异性结合的量增多,抗原与抗体结合发生氧化还原反应释放的电荷增多,峰电流逐渐增大,峰电流I(单位:μA)与MC-LR抗原质量浓度C(单位:ng/mL)线性相关且满足如下方程:

I=-17.7C-230.4

线性相关系数R2=0.97,如图7(b)所示。采用3SDblank/slope方法计算其检测下限(LOD)为0.33 pg/mL。

表2将本工作与不同方法检测MC-LR毒素的研究报道进行了对比,可以看出本工作采用SnO2量子线偶联MC-LR抗体进行MC-LR抗原检测,具有检测灵敏度高、检测下限低的优点。自然界水体环境复杂,可能存在Hg2+、Pb2+、Cd2+等重金属离子,因此研究该传感器对这些干扰离子的响应情况很有必要。本文采用上述方法制备的电化学生物传感器对Hg2+、Pb2+、Cd2+3种重金属离子的标准溶液进行DPV测试,并对测试结果进行归一化处理,如图7(c)所示,可以看出传感器对3种重金属离子的归一化响应值均小于0.2,说明这种基于SnO2量子线构建的电化学生物传感器具有较强的抗重金属干扰的能力。

表2 化学修饰电极用于微囊藻毒素MC-LR检测的性能对比

3 结论

本文利用SnO2量子线的高比表面积和大量的悬挂键、吸附位点丰富的特点,构建全固态电化学生物传感器。利用SnO2胶体量子线的配体中的羰基和羧基与MC-LR抗体的特性位点进行交联达到稳定修饰的目的,BSA封闭剂进一步提高了传感器对MC-LR抗原的特异性;MC-LR抗体与SnO2修饰层结合,形成离子接受和电子传输的功能层,提升了检测效率,从而实现了对MC-LR抗原的高特异性和高灵敏度检测。该传感器具有制备方法简单,使用方便的特点,可快速检测水体中的MC-LR。这种基于量子线修饰的电化学生物传感器具有检测成本低、平台拓展性强、检测速度快、选择性好等优点,具有广阔的应用空间。