circPRKCI靶向miR-448对高脂高糖诱导胰岛β细胞损伤的影响

王梅 谭金枚

胰岛β细胞质量和功能的逐渐下降是2型糖尿病的关键原因[1]。β细胞质量和功能对于维持葡萄糖稳态至关重要,而葡萄糖稳态受损会导致糖尿病的进展[2]。但是,β细胞功能和质量的持续丧失无法通过现有的治疗干预方案(节食、运动,甚至降血糖药物)停止和逆转[3]。因此,保护胰岛β细胞是预防糖尿病的有效途径。炎症是β细胞功能障碍的病理组成部分,炎性细胞因子的升高可能会导致β细胞异常[1]。大量的非编码RNA,如环状RNA(circular RNA,circRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)参与各种疾病。与线性RNA不同,circRNA是一类具有封闭结构、高稳定性的新型非编码RNA[4]。许多学者已经鉴定并揭示了circRNA在包括糖尿病在内的许多疾病中扮演的关键角色[5,6]。一些circRNA可以干扰miRNA及其靶基因水平,从而以多种方式在多种疾病中发挥作用。Qiu等[7]首次研究报告了一种来自3q26.2位点的新型circRNA,circPRKCI,它在肺腺癌组织中过度表达,充当miR-545和miR-589的海绵促进肺腺癌的增殖和肿瘤发生。此外,circPRKCI通过靶向不同的miRNA,减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的HK2细胞[7]或过氧化氢诱导的神经元细胞[8]损伤。许多miRNA已被证明在糖尿病病理学中至关重要[9]。据报道,缺血再灌注损伤后心肌细胞中miR-448上调[10],提示miR-448与细胞损伤有关。然而,迄今为止,circPRKCI和miR-448对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响和功能机制笔者尚未见报道。鉴于此,本研究假设circPRKCI可以通过与miR-448的相互作用来缓解糖尿病胰岛β细胞损伤,利用高脂高糖损伤胰岛β细胞的体外模型,对circPRKCI和miR-448进行上调或下调以鉴定二者在糖尿病胰岛β细胞损伤中的特定功能和作用。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠胰岛β细胞株MIN6(上海信裕),棕榈酸、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒(美国Sigma),circPRKCI过表达载体(pcDNA-circPRKCI)、pcDNA、circPRKCI沉默载体(si-circPRKCI)、si-NC、anti-miR-NC、miR-448抑制剂(anti-miR-488)、miR-NC、miR-448模拟物(上海GenePharma),抗鼠活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-caspase)3抗体、cleaved-caspase9抗体、IgG二抗(美国Abcam),Mir-miRNA First-Strand Synthesis Kit、PrimeScript RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒(大连Takara)。

1.2 细胞培养与高脂高糖损伤 胰岛β细胞在37℃和5% CO2环境下保持在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长。为了建立高脂高糖模型,将胰岛β细胞暴露于含33.3 mmol/L葡萄糖和0.25 mmol/L棕榈酸的培养基中保持48 h[11]。

1.3 实验分组 分为Con组(11.1 mmol/L葡萄糖)、Model组(高脂高糖模型,33.3 mmol/L 葡萄糖+0.25 mmol/L棕榈酸)、Model+pcDNA组(高脂高糖模型+转染pcDNA)、Model+pcDNA-circPRKCI组(高脂高糖模型+转染pcDNA-circPRKCI)、Model+anti-miR-NC组(高脂高糖模型+转染anti-miR-NC)、Model+anti-miR-488组(高脂高糖模型+转染anti-miR-488)、Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC组(高脂高糖模型+转染pcDNA-circPRKCI+miR-NC)、Model+pcDNA-circPRKCI+miR-448组(高脂高糖模型+转染pcDNA-circPRKCI+miR-448)。将胰岛β细胞以2×104个/孔接种到6孔板中,由Lipofectamine 2000试剂进行pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-488、miR-NC、miR-448模拟物转染,24 h后建立高脂高糖模型。收集处理结束后的胰岛β细胞进行评价。

1.4 qRT-PCR检测 circPRKCI、miR-448、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) mRNA和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β) mRNA表达来自不同处理胰岛β细胞的总RNA通过Trizol试剂获得。RNA的逆转录采用Mir-miRNA First-Strand Synthesis Kit或PrimeScript RT试剂盒进行,得到cDNA。PCR采用SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒进行。U6和GAPDH用作内部对照。选择2-ΔΔCt方法来评估数据。序列为circPRKCI F:5'-ATTCAGGGACACCCGTTCTT-3',R:5'-CTCTTCAGAACACTTGCAGCTT-3';miR-448 F:5'-CCCGCACGATTTCATTGAAC-3',R:5'-GAAGTCTGGGAATCGATCTGG-3'；TNF-α F:5'-CAGGGGCCACCACGCTCTTC-3',R:5'-CTTGGGGCAGGGGCTCTTGAC-3';IL-1β F:5'-TCCCTTCATCTTTGAAGAAGA-3',R:5'-GAGGCCCAAGGCCACAGG-3'。GAPDH F:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',R:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3';U6 F:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪FACSCalibur检测胰岛β细胞凋亡。胰岛β细胞(1×106细胞/孔)用磷酸盐缓冲液洗涤,用Annexin V-FITC和PI在37℃染色30 min。

1.6 Western blot检测cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达 通过RIPA裂解缓冲液裂解胰岛β细胞。接下来,在SDS-PAGE凝胶上分离后,将蛋白质样品转移到PVDF膜。然后,膜被封闭,并与抗鼠cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶2 000)4℃过夜。与IgG二抗(1∶5 000)孵育后,通过增强化学发光检测蛋白质水平。选择Image Lab软件量化每个抗体中的蛋白强度。

1.7 荧光素酶报告分析circPRKCI与miR-448的靶向结合 circPRKCI与miR-448的互补序列通过StarBase软件预测。在转染前将胰岛β细胞接种到6孔板并培养至60%的密度。将野生型(WT)或突变型(MUT)circPRKCI片段克隆到psiCHECK-2荧光素酶载体,分别命名为WT-circPRKCI、MUT-circPRKCI。然后将miR-NC或miR-448模拟物与WT-circPRKCI或MUT-circPRKCI共转染到胰岛β细胞中,分别持续48 h。最后使用Dual-Glo荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。另在胰岛β细胞中转染pcDNA、pcDNA-circPRKCI、si-NC、si-circPRKCI,持续48 h以qRT-PCR检测miR-448表达。

2 结果

2.1 circPRKCI和miR-448在高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤中的表达 高脂高糖诱导的胰岛β细胞后,与Con组比较,Model组胰岛β细胞中circPRKCI表达量减少,miR-488表达量增加(P<0.05)。见表1。

表1 circPRKCI和miR-448在高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤中的表达 n=9,

2.2 circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响 与Con组比较,Model组胰岛β细胞中circPRKCI表达量减少,凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达量增加,TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达量也增加(P<0.05)。与Model+pcDNA组比较,Model+pcDNA-circPRKCI组胰岛β细胞中circPRKCI表达量增加,凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达量减少,TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达量也减少(P<0.05)。见图1,表2。

图1 circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的影响;A 凋亡相关蛋白表达;B 细胞凋亡流式图

表2 circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响 n=9,

2.3 circPRKCI靶向调控miR-448的表达 基于StarBase软件生物信息学预测,认为circPRKCI与miR-448靶向结合。WT-circPRKCI与miR-448模拟物共转染后,相对荧光素酶活性比其与miR-NC共转染时降低(P<0.05),而MUT-circPRKCI与miR-448模拟物或与miR-NC共转染时相对荧光素酶活性无显著差异(P=0.646)。此外,转染pcDNA-circPRKCI的胰岛β细胞的miR-488水平比转染pcDNA降低,转染si-circPRKCI后miR-488水平较转染si-NC升高(P<0.05)。见图2,表3、4。

图2 circPRKCI的序列中含有与miR-448互补的核苷酸序列

表3 荧光素酶报告分析 n=9,

表4 circPRKCI调控miR-448的表达 n=9,

2.4 抑制miR-448表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响 抑制miR-448表达后,Model+anti-miR-488组胰岛β细胞的miR-488表达量比Model+anti-miR-NC组减少约0.65倍,且凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白、TNF-α mRNA和IL-1βmRNA表达量均比Model+anti-miR-NC组降低(P<0.05)。见图3,表5。

图3 抑制miR-448表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的影响;A 凋亡相关蛋白表达;B 细胞凋亡流式图

表5 抑制miR-448表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响 n=9,

2.5 上调miR-448表达逆转了circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的作用 上调miR-448表达后,Model+pcDNA-circPRKCI+miR-448组胰岛β细胞的miR-488表达量比Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC组增加约1.91倍,且凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白、TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达量均比Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC组提升(P<0.05)。见图4,表6。

图4 上调miR-448表达逆转了circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的作用;A 凋亡相关蛋白表达;B 细胞凋亡流式图

表6 上调miR-448表达逆转了circPRKCI过表达对高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤的作用 n=9,

3 讨论

2型糖尿病被认为是一种以胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能障碍为特征的慢性低度炎症性疾病[12]。然而,潜在的分子机制仍不清楚。胰岛β细胞是葡萄糖稳态的中心调节剂,因此,胰岛β细胞的功能调节一直是2型糖尿病研究的焦点[13]。本研究阐述了circPRKCI在高脂高糖处理的胰岛β细胞中的病理生理作用。研究结果表明,circPRKCI在高脂高糖处理的胰岛β细胞中显著减少,高表达的circPRKCI可有效防止高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤。

最近的研究表明,circPRKCI在癌症等中起着关键的重要作用[14,15]。此外,circPRKC1在LPS诱导的HK2细胞损伤中表达下调,过表达circPRKCI可减弱LPS诱导的HK2细胞中活力降低、细胞凋亡增加以及TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的产生增加,减轻其炎症损伤[8,16]。Cheng等[9]揭示过氧化氢处理的SH-SY5Y神经元细胞中circPRKCI的表达降低,而上调circPRKCI减弱了过氧化氢诱导的细胞死亡和细胞凋亡。Xiong等[17]在脓毒症患者中观察到circ-PRKCI表达降低,其具有预测脓毒症患者28 d死亡风险的价值。这些证据强有力的表明circPRKCI在不同疾病发展中的重要作用。然而,笔者发现很少有研究调查circPRKCI在高脂高糖胰岛β细胞损伤中的功能和机制。我们的研究发现,circPRKCI在高脂高糖处理的胰岛β细胞中下调。高表达的circPRKCI可以减轻胰岛β细胞的细胞凋亡和炎症损伤,这一点可通过高表达circPRKCI对凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达及炎性因子TNF-α和IL-1β表达的抑制作用来体现。其中胰岛β细胞中的炎性因子(TNF-α、IL-1β)和细胞凋亡率已被证明在高脂高糖条件下大幅增加[18]。这些结果表明circPRKCI在高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤中发挥一定的保护作用。

对于circRNA,充当miRNA海绵是最常报道的功能模式。本研究中,在线预测和荧光素酶报告分析表明miR-448时circPRKCI的靶标,并且其表达受circPRKCI负向调控。大多数关于miR-448的研究都集中在癌症研究上。例如,miR-448作为一种肿瘤抑制因子,在胶质瘤[19]、胰腺癌[20]、垂体腺瘤[21]等起作用。此外,先前的研究发现miR-448在调节性T细胞耗竭小鼠(自身免疫性疾病的代表性模型)和类风湿性关节炎患者中含量丰富,是显著表达的miRNA之一[22]。miR-448在脊髓缺血再灌注损伤和缺氧诱导的神经细胞损伤中上调,下调其表达可减轻脊髓缺血再灌注损伤[23]。miR-448在类风湿性关节炎大鼠滑膜组织中上调,miR-448的过表达能逆转lncRNAOIP5-AS1抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞进展和炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6)的作用[24]。在本研究中,我们验证了miR-448在高脂高糖损伤的胰岛β细胞中上调。并且抑制miR-448表达后,细胞凋亡与凋亡蛋白、炎性因子TNF-α和IL-1β表达降低,表明抑制miR-448表达可以改善高脂高糖诱导的胰岛β细胞损伤[25]。在此基础上,我们进一步证实上调miR-448表达逆转了高表达circPRKCI对高脂高糖作用下胰岛β细胞凋亡和炎症所产生的抑制作用,这一方面证明了miR-448在高脂高糖环境下胰岛β细胞损伤中的重要作用,另一方面表明circPRKCI保护高脂高糖损伤胰岛β细胞的效果与其靶向miR-448有关。

总之,本研究提供了新的证据表明circPRKCI可以减轻高脂高糖诱导的胰岛β细胞凋亡和炎性因子表达,推测机制为通过靶向miR-448来减轻胰岛β细胞的高脂高糖损伤。这些发现扩展了对circRNA功能的理解,并可能为治疗糖尿病胰岛β细胞损伤提供新的见解。