桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林对子宫肌瘤大鼠卵巢储备的影响

赵娜 周灵雪 杨向荣

子宫平滑肌瘤,是女性中最常见的盆腔肿瘤,通常会引起严重的不规则的长期经期出血,导致不育和流产[1];非手术治疗主要是使用GnRH激动剂来抑制E2和孕酮的循环水平[2]。在选择治疗方案时,重要的是要考虑该程序对卵巢储备的潜在影响,因为卵巢功能障碍可导致更年期发作加快和生育能力下降[3]。评估卵巢储备的方法包括超声检查基质血流和窦性卵泡计数以及测量血清FSH、E2和AMH的水平[4]。桂枝茯苓方的主要作用是补血,化瘀和消肿[5]。该配方的常用制剂是丸剂,胶囊剂,片剂和汤剂。对现代文献进行的文献计量学研究分析了桂枝茯苓灵丸治疗的疾病名称,发现中药发病率最高的是腹部肿块,西药疾病的最高发病率是子宫肌瘤[6]。舍瑞林是黄体生成素释放激素的合成十肽类似物,起激动剂的作用,刺激垂体[7]。临床上戈舍瑞林用于治疗患有前列腺癌,乳腺癌和各种良性妇科疾病(子宫内膜异位,子宫肌瘤,子宫内膜变薄和辅助生殖)的患者[8]。本项研究通过建立子宫肌瘤大鼠模型,探讨桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林对大鼠卵巢储备的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验大鼠:从河北北方学院实验动物研究所(土耳其马拉蒂亚)获得的40只健康成年雌性Wistar品系大鼠(3～4月龄)用于实验。大鼠饲养在标准实验室条件下[室温为(22±2)℃;光照/黑暗周期为12 h,上午7∶00点亮]。随意提供自来水和食物颗粒。实验程序和实验方案已获得地方动物伦理委员会的批准。

1.1.2 子宫肌瘤模型和分组:实验大鼠正常喂养1周。适应后,根据建立模型的随机数表分组,对照组(n=10)标准条件下饲养的实验大鼠,模型组(n=20)腹腔注射苯甲酸E2(0.5 mg/kg),1次/d,连续25 d,腹腔注射黄体酮(4 mg/kg),1次/d,连续5 d。治疗组(n=10)在模型大鼠的基础上,用桂枝茯苓胶囊(江苏康缘药业股份有限公司)用蒸馏水溶解,配制成0.10 g/ml的溶液,动物剂量为0.70 g·kg-1·d-1;戈舍瑞林(英国,阿斯利康),用蒸馏水溶解,制成0.5 mg/ml的溶液,剂量为1.25 mg·kg-1·d-1,对大鼠进行联合胶囊溶剂治疗,持续6周。正常组和模型对照组每天0.9%氯化钠溶液灌胃4周。给药后,将大鼠禁食12 h,过夜,不限制饮水量,称重。用30%(V/V)水合氯醛(3 ml/kg)进行腹腔麻醉,取出每只大鼠的子宫进行测试。所有实验方案按照美国国家卫生与医学研究委员会的实验动物护理指南进行。

1.2 方法

1.2.1 组织样本采集与称重:实验结束时,将所有大鼠麻醉(2.5 mg/kg Alfazyne和12.5 mg/kg Ketalar),称重,并通过心脏穿刺获得血样。立即分离血清和血浆,并保持在20℃进行后续分析。采集血液样本后,迅速将大鼠的2个卵巢取出并清洗和称重。左卵巢固定在10%中性甲醛缓冲液中以进行光学显微组织处理,而右卵巢的一半固定在2.5%戊二醛中以通过电子显微镜进行超微结构评估。将右卵巢的另一半迅速冷冻在40℃进行生化分析。用组织匀浆器在PBS(1/10;重量/体积)中将组织匀浆。将样品离心并收集上清液以进行分析。

1.2.2 激素测定:使用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒定量测定大鼠血清样品中的E2,FSH,黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)和AMH (中国浙江)。

1.2.3 组织学和卵泡计数:为了评估卵巢结构和卵泡数量,苏木精-伊红染色在卵巢的第10个部分进行,以使每个部分与下一个第10个部分相隔约50～60 μm的距离。根据以下定义对卵泡进行计数:原始卵泡;被薄层,单层的所谓滤泡上皮细胞包围。初级卵泡;卵母细胞周围的单层或多层滤泡上皮变成等棱形或高度棱柱形。次级卵泡;卵泡中卵母细胞被两层以上的颗粒细胞覆盖,并且开始形成胃窦。Graafian(第三级)卵泡;卵泡,卵泡具有充满卵泡液的单个大窦腔,其中颗粒细胞围绕窦腔,卵母细胞被一些颗粒细胞(卵丘细胞)包围。卵泡滤泡颗粒细胞中的退化性透明带或卵母细胞以及融合。窦腔内有颗粒细胞和细胞碎片。所有切片均用光学显微镜(Leica DM 1000)进行评估,并用连接的数码相机(Leica DMC 2900)进行监控。

1.2.4 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析:TUNEL测定法用于检测DNA损伤。按照制造商的说明进行测定程序(S7101;Apoptag Plus过氧化物酶原位细胞凋亡试剂盒,默克密理博,德国达姆施塔特,德国)。将取自每组卵巢中央水平的切片在甲苯中脱蜡,并通过一系列分级的乙醇和双蒸馏水进行复水。载玻片用PBS冲洗并保存在蛋白酶K(圣路易斯,密苏里州)中进行抗原回收。将切片与3%H2O2(默克公司,德国达姆施塔特,德国)一起孵育5 min,漂洗,在室温下与1×平衡缓冲液一起孵育10 min。将TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)反应溶液在37℃下应用1 h,不同的是使用蒸馏水代替TdT酶作为阴性对照。将切片在室温下置于停止/洗涤缓冲液中10 min。将抗洋地黄毒苷-过氧化物酶缀合物应用于切片。将DAB用作色原后,将切片用甲基绿(Trevigen的TM)复染。在所有类型的卵泡中,TUNEL(+)细胞占总细胞数的百分比均记录为凋亡指数。

1.2.5 生化分析氧化应激:使用Teflon玻璃匀浆器在150 mmol/L KCl(pH 7.4)中以整个匀浆的1∶10(w/v)稀释液对组织进行匀浆。将匀浆液在18 000×g和4℃下离心30 min,以确定MDA和GSH浓度以及SOD和CAT活性。

1.2.6 蛋白质印迹分析:通过Bradford试剂测定均质样品中的蛋白质浓度。之后,将40 μg蛋白质在12%SDS-PAGE上分离并转移至硝酸纤维素膜(sc-3718,圣克鲁斯生物技术)。用在Tris缓冲盐水(TBS)中的5%脱脂脱脂奶粉(Sigma,70166)封闭膜。将膜在TBST(含0.1%Tween-20的TBS)中洗涤2次,并与一抗(1∶500单克隆大鼠抗caspase-3,sc-7148,caspase-1,sc-47778,Santa Cruz)孵育过夜生物技术)。将膜与结合了HRP的二抗(1∶1 000山羊抗小鼠IgG1-HRP)一起温育2 h。用试剂盒试剂(sc-2048,圣克鲁斯生物技术试剂盒)显影印迹。使用Image J OD分析软件分析数据。关于β-肌动蛋白将信号标准化。

1.2.7 组织病理学检查:固定后,将样品包埋在石蜡中。使用Leica RM2125RTS从5 μm的石蜡块上切下切片,并用苏木精和曙红染色。在光学显微镜(东京,日本)下检查所有载玻片。卵巢损伤的标准是间质性水肿,扩张,出血,多形核白细胞浸润(PNL)和滤泡细胞变性(颗粒细胞)。对于每个样本,标准的评分为0～3分(0 =无;1 =轻度;2 =中等;3 =严重)。卵泡根据平均直径分为几类:原始的(<20 μm),窦前的(20～220 μm),小肛门的(221～310 μm)和大肛门的(311～370 μm)。卵巢切片由同一位病理学家检查,他们对测试组不知情。

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件,采用单向方差分析和事后Tukey的显著差异检验对生化值进行分析,采用Kruskal-Wallis方差分析比较组织学结果,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗干预降低体重和卵巢的重量 模型组较对照组的身重和器官卵巢重量升高(P<0.05),治疗组较模型组降低(P<0.05),说明桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林治疗降低子宫肌瘤大鼠的体重。见表1。

表1 大鼠体重和器官称重 g,

2.2 激素水平检测 使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒对各实验组大鼠进行血清激素水平检测,模型组较对照组E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高(P<0.05),治疗组较模型组E2和AMH水平升高,FSH和LH水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠血清激素水平检测

2.3 大鼠卵泡计数分析 通过组织学分析大鼠卵巢卵泡的发育情况,模型组较对照组原始卵泡、Graafian卵泡及黄体数量减少,次级卵泡和卵泡滤泡增多(P<0.05),治疗组较模型组原始卵泡、Graafian卵泡及黄体数量增多,次级卵泡和卵泡滤泡减少(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠卵泡计数分析

2.4 TUNEL方法评估颗粒细胞 在电镜下观察发现,与对照组相比,PCOS组卵泡颗粒细胞凋亡(黑色箭头表示)指数增加(P<0.05)。模型组的凋亡主要出现在Graafian卵泡颗粒细胞中。与模型组相比,治疗组TUNEL(+)颗粒细胞数量减少(P<0.05)。见图1。

图1 TUNEL方法评估颗粒细胞凋亡(苏木精染色×200)

2.5 大鼠卵巢氧化应激水平分析 对大鼠卵巢匀浆稀释液进行氧化应激水平分析,模型组较对照组MDA和CAT水平升高,GSH和SOD水平降低(P<0.05),治疗组较模型组MDA和CAT水平降低,GSH和SOD水平升高(P<0.05),数据表明干预治疗后能降低子宫肌瘤大鼠卵巢中的氧化应激水平。见表4。

表4 大鼠卵巢氧化应激水平分析

2.6 干预治疗抑制凋亡蛋白的表达 通过蛋白印迹分析大鼠卵巢Caspase-3和Caspase-1的表达,模型组较对照组Caspase-3和Caspase-1的表达升高(P<0.05),治疗组较模型组Caspase-3和Caspase-1的表达降低(P<0.05)。见图2,表5。

图2 Caspase-3和Caspase-1蛋白印迹分析

表5 Caspase-3和Caspase-1蛋白质表达水平

2.7 卵巢组织损伤评分 模型组较对照组的水肿、扩张、出血和白细胞浸润评分升高(P<0.05),治疗组较模型组降低(P<0.05),说明桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林保护子宫肌瘤大鼠的卵巢损伤。在对照组中观察到正常的卵泡和黄体,模型组显示血管扩张(粗箭头),出血(细箭头),滤泡变性(箭头颈)和多形核淋巴细胞浸润(星形)。治疗组中观察到轻度出血(细箭头),血管扩张(粗箭头),滤泡变性(箭头颈)和多形核淋巴细胞浸润(星形),较模型组损伤减轻(P<0.05)。见表6,图3。

图3 大鼠卵巢显微镜外观(HE×100)

表6 大鼠卵巢组织病理学评估 分,

3 讨论

子宫肌瘤的发生随着年龄增加而增加,在绝经年龄左右最高,此后会减少,症状取决于肿瘤的大小和位置[9]。然而,绝大多数的肿瘤无症状,并且是常规妇科检查(双手或超声检查)中偶然发现的[10]。肌瘤最常见的体征和症状包括月经周期紊乱大出血和月经疼痛,与盆腔疼痛相关的盆腔肿块,泌尿问题或便秘[10]。子宫肌瘤,尤其是黏膜下和壁内肌瘤也可能引起不孕和复发性流产[11]。对于肌瘤的治疗,有多种治疗选择,包括手术治疗,非手术替代方法和药物治疗[12]。最初,子宫切除术被认为是有症状肌瘤的一种治疗选择[13]。如今,由于人们越来越关注患者的生活质量和个性化的治疗期望,治疗的选择取决于患者的年龄以及意愿。

卵巢储备是个体生殖潜能的量度,理解为剩余卵母细胞的数量和质量[14]。卵巢储备主要用于预测对卵巢刺激的反应。降低的卵巢储备有时被称为原发性卵巢功能不全,不同于更年期和卵巢早衰[15]。据认为,卵巢储备降低导致卵巢反应差(卵泡数量减少,胚胎数量减少和消除率增加)以及受精能力降低。但是,笔者发现目前尚无统一的卵巢储备降低定义。生化和超声检查可以间接评估卵巢储备。生化测试包括FSH、E2、抑制素B和AMH以及克罗米芬柠檬酸盐激发试验。窦卵泡计数和卵巢体积是用于评估卵巢储备的超声检查[16]。根据目前的指南,FSH是降低卵巢储备的最常用筛查方法,但卵泡计数和AMH是最有前途的预测指标。许多因素,例如化学疗法或放射疗法子宫肌瘤以及吸烟可能会对卵巢储备产生负面影响。

研究对卵巢功能的影响依赖于血清激素水平,特别是FSH,E2和AMH的分析[17]。FSH从垂体释放,刺激未成熟卵泡的生长[18]。当卵巢储备(以剩余卵泡的数量来衡量)减少或减少时,由于抑制素B(垂体卵泡释放的激素)对垂体的负反馈减少,FSH升高[19]。因此,在月经周期第3天测得的FSH水平升高(410 mU/ml),表明卵巢储备下降。E2从窦状卵泡释放;因此,在较高的FSH水平的影响下较低的E2水平表明卵巢储备减少。AMH也从窦腔卵泡中释放,因此较低的AMH水平是卵巢储备减少的标志[20]。超声检查也可用于测量卵巢体积,窦房卵泡计数,卵巢间质血流量,卵巢动脉灌注和卵巢动脉抵抗指数。血清激素测试可提供有关剩余卵巢储备的信息,并且可以用来推断卵巢的功能。

在这项研究发现,药物诱导子宫肌瘤会导致卵巢储备减少,这与组织氧化应激增加,荷尔蒙变化受损和组织学损害增加有关。模型诱导后,大鼠的体重和卵巢重量增加,E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高,这对卵巢功能尤其是储备特别不利,并且卵巢组织具有超出对照组的氧化应激。相比之下,接受桂枝茯苓胶囊和戈舍瑞林药物治疗的大鼠的组织氧化应激参数,卵巢储备标志物和组织病理学变化得到了明显改善。MDA是脂质过氧化作用的最终产物,含量增加反映了氧化应激。相反,谷胱甘肽水平的升高以及SOD,CAT和GPx的活性表明氧化损伤后组织的愈合。氧化应激通过抑制卵母细胞的核和细胞质成熟并诱导凋亡而导致卵巢衰竭。本研究结果还表明,子宫肌瘤病变诱导的卵巢功能不全后,桂枝茯苓胶囊和戈舍瑞林可以改善卵巢储备标志物。与模型组相比,治疗组的AMH和E2水平增加,而FSH和LH水平则下降。同时表明联合治疗可改善子宫肌瘤卵巢组织中的组织学参数,例如出血,血管充血和单核细胞浸润。另一方面,Caspase-3和Caspase-1是caspase级联反应的重要组成部分,已与细胞凋亡依赖性信号通路相关。在本研究中,通过免疫印迹法检测Caspase-3和Caspase-1蛋白的表达,联合治疗抵消卵巢细胞的凋亡,还通过测量卵泡计数评估了联合治疗对卵巢储备的保护作用,观察到窦前和较小的肛门卵泡的损失较小。

综上所述,桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林可降低子宫肌瘤大鼠卵巢组织氧化应激和组织病理参数,改善激素水平,提高卵巢储备。