凋亡蛋白Caspase-9/Caspase-3在慢性间歇性低氧模型小鼠肝损伤中的作用

余孝海　刘国莹　钟明奎

摘要：目的探索凋亡蛋白Caspase-9/Caspase-3在慢性间歇性低氧模型小鼠肝损伤中的作用。方法将雄性C57小鼠随机分为正常氧对照组（Sham）、慢性间歇性低氧组（CIH），CIH组小鼠放入低氧仓进行间歇性低氧处理（8 h/d，连续28d）。4周后HE 染色显微镜下观察肝部病理形态学改变，比较两组小鼠血清指标白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平。用Western blot检测小鼠肝组织中凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的水平。结果与Sham组相比，CIH组肝组织形态学病理改变受损严重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平显著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表达上调。结论慢性间歇性低氧引起肝损伤，机制可能与凋亡蛋白上调相关。

关键词：慢性间歇性低氧，肝损伤，凋亡蛋白

中图分类号：R531.8

文献标识码：A

文章编号：1674-9545（2023）03-0102-（05）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.03.019

间歇性低氧（chronicinter—mittent hypoxia，C1H）是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）最为典型的病理生理特征，OSAS可以引起代谢综合征损伤多种器官^[1]。氧化应激是指体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）与抗氧化剂和活性氮之间的一种动态平衡被打破。缺血再灌注模型可以模擬OSAS患者睡眠中反复出现的缺氧-复氧损伤，缺氧-复氧破坏了患者体内抗氧化剂和促氧化剂平衡系统，体内过量产生ROS，从而导致过氧化损伤^[2]。缺氧还可以造成引起慢性炎症，慢性炎症也是OSAS重要的病理生理学特征。OSAS引起的CIH在体内可过量产生ROS，ROS的过度激活主要是两方面参与机体调节，一方面参与体内氧化应激反应，另一方面可以作为第二信使，可以激活低氧诱导因子-1α和核因子kB（Nuclear Factor-kB ，NF-kB）等核转录因子，NF-k B通路是比较常见的炎症信号通路，同时可以使白介素IL-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）活化，引发炎症反应^[3，4]。 同时有研究显示，CIH可以促进非酒精性肝病（nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD）患者的病情变化，从脂肪肝不断进展为肝硬化、甚至是肝癌。即使是没有伴随NAFLD大鼠，CIH也可通过促进一系列炎症反应，从而调控炎症因子活性，一定程度造成肝损伤^[5-6]。氧化损伤与细胞凋亡有很大关系，氧化损伤是导致肝损伤的原因之一。该研究目的是建立慢性间歇性低氧模型，观察慢性间歇性低氧时凋亡蛋白在肝脏损伤中的作用，探讨慢性间歇性低氧模型（CIH）小鼠对肝损伤机制。

1.1 材料

1.1.1 动物 实验动物清洁级雄性C57小鼠，（n=16，体重=27±4g），由安徽长临河医药科技有限公司，按照安徽医科大学实验动物保护条例执行，并严格遵守，合格证号 Scxk（皖）2017-001。实验小鼠被养在标准笼中，每笼不超过8只，12 h暗光循环保证昼夜节律，饲养期间不干预小鼠进食和饮水，动物房环境保持良好的通风和温湿度条件。自由进水和实物充分，室内温度保持18～25℃，小鼠的使用严格执行《中华人民共和国实验动物管理条例》。

1.1.2仪器 测氧仪（CYS-1型，购自南京新飞分析仪器公司）；液氮罐（医用，成都金凤液氮容器有限公司）；酶标仪（南京德铁实验公司）。

1.1.3 试剂 压缩氧气（浓度大于99. 9%） 、压缩氮气（浓度大于99. 99% ，高纯氮气） 都是由合肥市医用氧气厂提供；谷丙转氨酶（glutamie-pyruvic transaminase，ALT）（长春汇力公司）、谷草转氨酶（glutamic-Oxalacetie transaminase AST）；（长春汇力公司）；Caspase3 antibody、Caspase9 antibody（博奥森生物技术有限公司）。白介素-l（interleukin-1，IL-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（北方生物公司）。

1.2方法

1.2.1慢性间歇性低氧模型的制备和分组 小鼠在饲养一周后进行实验，随机分成Sham组、CIH组，每组均为8只。该实验的原理是利用氮气稀释原理，对照该实验室先前的造模方法，将实验组小鼠轻轻放入含有测氧仪探头的低氧舱内，实时显示数据，通过测氧仪探头监测氧浓度，通过两个旋钮调节氧气和氮气气体流量，氧浓度始终控制在6～21%范围内。氧气和氮气由两个旋钮阀门控制，一个循环时间为9 min，先充入氮气4 min ，使低氧舱内的氧浓度下降到约6% ，保持约 40 s ；随即充入氧气5 min ，氧浓度恢复至最高约21%，保持约 40 s，循环往复周期，每天8 h（ 9∶00 am～5∶00 pm） 共28d。造模第28d之后，将小鼠处死，进行下一步实验。

1.2.2体重的测定 低氧模型制备完成之后，首先进行小鼠体重测量。

1.2.3 组织学观察小鼠的肝脏 小鼠的肝组织被清水洗涤之后，用滤纸包裹吸干，多聚甲醛对其进行冲洗，同时准备含有多聚甲醛溶液的试管，在其中固定，实验室脱水机脱水之后，石蜡包埋技术将肝组织包埋成蜡块以备后期观察，将肝脏蜡块标本切成4μm 薄片，随即放入温水中任其自由展开，展开后用载玻片捞出，放入90℃烘烤箱中，约20 min后进行脱蜡，准备染色并封片，用光学显微镜下放大200倍观察肝脏部病理改变，同时截图留存。

1.2.4 血清指标的检测 实验结束后，采用眼球取血，提前加入抗凝剂，离心后提取血清，ALT和AST水平采用化学法测定，放射免疫分析法检测测定IL-1、IL-6水平，具体操作参照相应试剂盒说明。

1.2.5 小鼠肝脏凋亡蛋白的测定 小鼠处死后，在冰盘上取出肝脏，取适量肝脏组织与对应剂量的RIPA裂解液在研钵器中充分研磨，裂解液的成分为：150 mol/L NaCl、50 mol/L Tris·base、1% NP-40、50 mol/L NaF、1% PMSF，充分研磨成匀浆后，放在4℃冰箱里，10min离心，用枪头提取上清液，分别装于准备好的EP管中，临时保存于-20℃冰箱中。

1.4统计学处理 实验结果x-±s表示，用SPSS 26.0软件对数据做统计分析两组之间的比较采用配对t检验，多组之间的比较选用单因素方差分析（ANOVA），p＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1慢性间歇性低氧对小鼠肝细胞结构的影响 正常组在显微镜下肝脏组织细胞形态正常，排列整齐，大小规整，细胞无明显变性及坏死情况。显微镜下低氧组肝脏组织中肝细胞肿大及空泡化明显，细胞排列紊乱无序，有细胞出现变性及坏死，有炎症细胞聚集现象。

2.2慢性间歇性低氧对小鼠体重的影响 与Sham组相比，间歇性低氧28d后，CIH组小鼠体重[（25.53±1.49）vs（21.28±1.77），p＜ 0.05，]明显减轻，见图 2。

2.3慢性间歇性低氧对小鼠肝脏生化血清指标的影响 肝脏生化血清指标显示CIH组ALT水平[（37.63±9.89）vs（63.06±11.79），p＜0.05]，AST水平[（88.74±13.56）vs（157.56±20.96），p＜0.05]显著高于Sham组，见图3。

2.4 慢性间歇性低氧对凋亡蛋白的影响 与Sham组相比，间歇性低氧28d后，CIH组凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9的蛋白表达上调，见图4。

2.5 慢性间歇性低氧对小鼠肝脏生化血清指标IL-1、IL-6的变化

血清指标显示CIH组IL-1水平[（94.13±24.07）vs（134.06±21.02），p＜0.05]，IL-6水平[（61.99±7.66）vs（140.06±20.30），p＜0.05]显著高于Sham组，见图5。

3讨论

OSAS以CIH最为典型病理生理学特征之一，是一种危险性比较高的疾病类型，OSAS可引起高血压、糖尿病和代谢综合征等多种疾病。根据最新研究调查显示：大概35～45％的肥胖患者伴有OSAS，超过4％的普通人群也患有OSAS^［7］。实验发现经过间歇性低氧處理28 d后，CIH组肝脏组织中肝细胞肿大及空泡化明显，细胞排列紊乱无序，有细胞出现变性及坏死，有炎症细胞聚集现象，显微镜下CIH组肝组织形态学病理改变受损严重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平显著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表达上调，结果提示慢性间歇性低氧引起肝损伤，机制可能与凋亡蛋白上调相关。间歇性低氧一段时间后小鼠体重降低，由于低氧环境对小鼠产生应激反应，小鼠减少摄食，导致体重减轻。有关文献研究发现：间歇性缺氧可通过诱导脂代谢紊乱导致脂肪肝的发生，脂代谢紊乱导致脂肪肝的发生同低氧水平呈正相关^［8-9］。CIH的最典型特征是机体不断发生的血氧去饱和，同时ROS产生的重要来源也可以是组织氧利用度的振荡不断变化，机体在过氧化物与抗氧化物的相互失衡可产生过量的ROS，ROS的产生引起氧化应激反应，氧化应激可通过DNA损伤、细胞功能障碍、诱导凋亡、信号通路的激活等一系列途径加重肝损伤。细胞内线粒体作为维持细胞基本功能的关键细胞器，很容易不同程度上受到氧化应激的影响，线粒体功能异常会进一步促进内源性的 ROS 产生^［10］，氧化损伤与细胞凋亡有很大关系，氧化损伤与肝损伤密切相关，Caspase-9是诱导细胞凋亡经过线粒体途径的主要指标之一，Caspase-9被激活后促进慢性间歇性低氧诱导肝细胞凋亡，Caspase-3在各种凋亡方式中扮演了执行小分子，所以它被认为是细胞凋亡的标志，同时Caspase-9被激活后引起一系列反应，下游Caspase-3被激活，通过线粒体途径诱导细胞凋亡，从而导致肝损伤^［11-13］。OSAS对肝脏的损伤主要是病理性改变，表现为肝脏出现不同程度的损伤、炎症、纤维化等^［14］。HIF是在缺氧情况下机体内重要转录因子，分为α亚基和β亚基，α亚在低氧环境下，一般结构稳定，而在常氧环境下不稳定而降解，与β亚基结合而发挥相应作用，缺氧时，由于HIF-1αm RNA表达增加，增加HIF-1α活性及相关蛋白稳定性，重新获得氧气后HIF-1α蛋白降解，HIF-1α和其结合序列多种基因作用来完成细胞缺氧反应性的调节^[15]。

细胞发生凋亡的过程中，有Caspase依赖机制，也有非Caspase依赖机制。陈素艳等^[16]对缺血再灌注模型取样后，检测脑组织凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3m RNA水平，提示凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3 m RNA的水平上调在48 h达到顶值，然后不断下降，研究表明缺血再灌注模型大鼠神经损伤与凋亡蛋白上调密切相关，凋亡蛋白Caspase是凋亡中重要的分子。本研究发现，小鼠慢性间歇性低氧28 d后，间歇性低氧组肝组织形态学病理改变受损严重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平显著升高，凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表达上调，提示慢性间歇性低氧引起肝损伤，机制可能与凋亡蛋白上调相关。凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9可能参与慢性间歇性低氧引起肝损伤。

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（责任编辑 胡安娜）