检测时间和保存方式对饮用水源水中粪大肠菌群测定的影响

杨红力 刘晶

（北京中职安康科技有限公司环境实验室，北京 101399）

1 引言

粪大肠菌群（Fecal Coliforms）作为一种粪便污染的指示微生物［1］，具有污染水源从而导致人体肠道疾病的风险［2］，是饮用水源水生物安全中一项重要的检测指标［3］。由于粪大肠菌群的微生物学属性，其生长和繁殖符合微生物生长曲线，即大致经历迟缓期、对数生长期、稳定生长期、衰亡期4 个生长时期［4］，故其性质和一般的理化指标完全不同［5］，对样品检测时间和保存条件的要求比较特殊［6］。对于这类样品，一般的原则是冷藏保存，快速检测。现行的世界各地的标准要求也是这样规定的［7］，如中国的要求是采样后2 h 内检测，或0～10 ℃保存，6 h 内检测［8-10］；美国是采样后0～10 ℃保存，8 h 内检测［11］；欧盟是采样后5±3 ℃保存，8 h 内检测［12］；世界卫生组织则要求采样后2 h 内检测，或4～10 ℃保存，24 h内检测［13］。总体上都遵循冷藏保存、快速检测的原则。但实际工作中因长距离运输，如异地采样，微生物样品在检测之前已经保存了较长时间［14-15］，使最终检测结果的有效性难以保证［16-17］，因此对微生物样品检测时间和保存时间的研究非常必要。

目前对微生物样品检测时间和保存方式的研究多集中在最长保存时间和不同温度点的验证方面［18-19］，对季节因素、试验结果有效性和不同检测方法比较的研究鲜有报道。粪大肠菌群现行的检测方法有发酵法、滤膜法、酶底物法、纸片法、聚合酶链式技术等，其中前3 种是比较常用的方法［20-22］。本研究拟在现行标准要求的条件下，以水源水中粪大肠菌群为指标，选取上述较常用的3 种方法，在不同季节、不同保存条件、不同时间段内检测目标微生物，最后参照GB 3838—2002《地表水环境质量标准》［22］，以检测数据的有效性, 针对不同标准中对微生物水样检测时间和保存条件规定的合理性进行探讨。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

仪器：车载冷藏箱（北京优冷，RL-350YS），无菌采样袋（青岛海博，45 cm×55 cm），高压蒸汽灭菌器（上海三申，YX280），超净工作台（济南鑫贝西，BBSSDC），生化培养箱（上海一恒，LRH-250），拍打式均质器（北京陆桥，B01），紫外灯（上海历辰，365 nm），97 孔定量盘（爱德士，美国），程控定量封口机（爱德士，CHQC-20），乳糖蛋白胨培养基（陆桥，北京），EC肉体培养基（陆桥，北京），MFC 培养基（陆桥，北京），ONPG-MUG 培养基（Colilert，美国）。试剂：粪大肠菌群QC 试剂（爱德士，美国）。

2.2 样品采集

分别在冬季和夏季以无菌采样的方法采集某水源水引水渠水样，采样点离实验室约20 min 车程，采样时记录当时气象条件。样品采集后分两批保存，一批立即保存于灭过菌的车载冷藏箱内（内部温度3 ℃），另一批保存于灭过菌的常温样品箱内。两批样品同车运送，20 min 内送至实验室检测。

2.3 样品分析

按照标准方法，采用多管发酵法、滤膜法、酶底物法3 种方法，分析不同季节、不同保存方式下的样品。第一阶段间隔为每0.5 h 1 组，至6.0 h 后进入第二阶段，时间间隔为每2.0 h 1 组，至10.0 h 后进入第三阶段，即24.0 h 后加测1 组，共15 组。每测1 组均记录当时水样温度和室温，每组样品测试前需经均质器拍打，保证样品的均质性。阴性对照、阳性对照和QC 质控试验随各阶段同步进行。

2.4 数据统计与分析

本研究采用单因素方差分析检验不同分析方法对检测结果的影响，利用双因素方差分析探讨检测时间和保存方式对检测结果的影响，利用t 检验比较同一检测时间时不同保存方式对检测结果的影响。数据统计分析在R 软件中进行。

3 结果与讨论

3.1 不同季节粪大肠菌群生长结果

3.1.1 冬季试验结果

样品采集后常温保存，2.0 h 内样品温度从1.5 ℃升至2.9 ℃，粪大肠菌群繁殖缓慢，从140 个/L 生长到200 个/L（发酵法），结果均符合GB 3838—2002《地表水环境质量标准》的限值要求（≤2 000 个/L），甚至24.0 h 后结果依然符合要求，说明室温2.0 h 检测的标准要求合理有效。冬季常温保存条件下，不同检测时间粪大肠菌群检测结果见表1。

表1 冬季常温保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果

样品采集后冷藏保存，6.0 h 内样品温度从1.4 ℃升至3.3 ℃，粪大肠菌群繁殖仍然缓慢，从110 个/L生长到240 个/L（发酵法），结果均符合GB 3838—2002《地表水环境质量标准》的限值要求（≤2 000 个/L），甚至24.0 h 后结果依然符合要求，说明冷藏6.0～10.0 h 内检测的标准要求合理有效。冬季冷藏保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果见表2。

表2 冬季冷藏保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果

3.1.2 夏季试验结果

样品采集后常温保存，2.0 h 内样品温度从27.3 ℃升至28.5 ℃，粪大肠菌群快速繁殖，从540 个/L 生长到5 400 个/L（发酵法），0.5 h 检测结果（540 个/L）和1.0 h 检测结果（1 400 个/L）均符合GB 3838—2002《地表水环境质量标准》的限值要求（≤2 000 个/L），而1.5 h 检测结果（2 200 个/L）和2.0 h 检测结果（5 400 个/L）则不符合标准要求，即样品由于保持不当和检测滞后而致使结果超标，说明2.0 h 内检测的标准要求在夏季不适用。10.0 h 和24.0 h 后，粪大肠菌群已经迅速繁殖。夏季常温保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果见表3。

表3 夏季常温保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果

样品采集后冷藏保存，6.0 h 内样品温度从26.1 ℃降至6.2 ℃，粪大肠菌群正常繁殖，从520 个/L 生长到1 700 个/L（发酵法），结果均符合GB 3838—2002《地表水环境质量标准》的限值要求（≤2 000个/L），6.0 h 后粪大肠菌群则繁殖加快，至8.0 h 时结果超标，说明冷藏保存条件下6.0 h 检测的标准要求合理有效。夏季冷藏保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果见表4。

表4 夏季冷藏保存条件下不同检测时间粪大肠菌群检测结果

3.2 3 种检测方法对检测结果的影响

采用单因素方差分析检验不同粪大肠菌群检测方法之间的差异，结果表明，3 种检测方法对不同季节和不同保存方法下的检测结果的影响无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 3 种检测方法对检测结果的影响（单因素方差分析）

3.3 不同季节检测时间和保存温度对粪大肠菌群检测结果差异性分析

利用双因素方法分析和t 检验分析了检测时间与保存温度对检测结果的影响，具体结果如图1。从图1 可以看出，在冬季，随着检测时间的延长，粪大肠菌群检出的数值显著增加（P＜0.001）。总体来看，常温保存下的粪大肠菌群检测结果要大于冷藏保存（P＜0.05）。在夏季，取样后0.5 h 时检测，不同保存方式（常温、冷藏）对粪大肠菌群检测结果的影响无统计学意义（P＞0.05）。但取样后1.0 h 时检测，常温保存样品中粪大肠菌群的检出数值显著高于冷藏保存样品（P＜0.01）。并且随着检测时间的延长，检测结果在两种保存方式之间的差异越来越大。

图1 检测时间和保存温度对检测结果的影响

4 讨论

从试验数据和统计结果可见，在冬季，无论样品冷藏还是常温保存，2.0 h 内检测和10.0 h 内检测对结果的有效性影响不大，甚至24.0 h 后检测结果依然符合要求。说明在冬季室温较低的情况下，保存条件（冷藏或常温）和检测时间（10.0 h 内）对粪大肠菌群检测结果的影响不显著。虽然如此，但冷藏样品检测结果的波动（10.0 h 内从110 个/L 生长到270 个/L）明显小于常温保存（10.0 h 内从140 个/L 生长到520 个/L）。对于较干净的水样，这种波动也许可以接受，但对于污染的水样，则有可能不能完全反映其受污染的程度。因此，在冬季，冷藏保存同样很有必要。

夏季，由于气温高，微生物繁殖旺盛，样品常温保存时，2.0 h 内甚至1.5 h 内粪大肠菌群已经繁殖到超出限值，而冷藏保存6.0 h 内检测，则对结果的有效性影响不大。这说明在夏季高温环境下，保存条件（常温）和检测时间对粪大肠菌群检测结果的影响显著，如此则“采样后2.0 h 内检测”的标准要求便值得再商榷。

经过分析，3 种检测方法对检测结果的影响无统计学意义，但从检测结果上看，无论是冷藏还是常温保存，发酵法的结果都比另外2 种方法偏高，滤膜法和酶底物法在数值增长上比较一致，可见相比前者，后2 种方法的数据更符合实际。

5 结论

通过对检测数据的统计与分析，本研究主要得出以下结论：

（1）对于样品检测时间和保存方式，现行标准的要求值得进一步商榷，应该考虑季节的因素，如夏季采样时，在常温保存条件下，采样后1.0 h 内检测，或0～4 ℃保存6.0 h 内检测；冬季采样，常温保存条件下，采样后6.0 h 内检测，或0～4 ℃保存10.0 h 内检测。

（2）无论冬季还是夏季，常温保存样品的检测结果均大于冷藏保存，因此，冷藏保存、迅速分析的原则应一直贯彻。

（3）就检测方法而言，滤膜法和酶底物法更能客观反映样品的实际情况，且在冬季冷藏保存条件下，粪大肠菌群在10.0 h 内的结果均合理有效，对解决样品的长距离运输问题也具有现实意义。