基于综合情绪Z值的小鼠观察性恐惧习得性别差异研究

付 圆，石天尧，周文霞

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

恐惧是显著而强烈的负性情绪状态，通过观察他人经历创伤痛苦而间接获得对环境中潜在威胁的恐惧被称为观察性恐惧习得（observational fear learning，OFL），是获得恐惧的主要途径之一［1-2］。目睹和听闻他人经历创伤事件可导致不同程度的恶劣心境和持续的恐惧，进而诱发恐惧相关的精神障碍，例如创伤后应激障碍［3-5］。如目睹或了解家庭成员的死亡或遭受攻击，会增加罹患创伤后应激障碍的风险［6］。同样的情况也发生在那些接触到非亲属（即非家庭成员）经历创伤的专业人士，比如一线医疗救护者和地震救援人员等［7］。此外，这类精神创伤疾病可造成社交能力缺陷，增加患者社会生存的难度。因此，研究OFL 对于了解人类精神创伤的发生及对相关情绪障碍的干预和治疗具有重要意义。

以往针对OFL 的研究大多以雄性动物或男性为受试对象［8-10］，而通过观察获得恐惧的性别差异则长期被忽视。在啮齿类动物观察性习得研究中，也只有少数研究对性别差异进行了统计分析。一项关于朗埃文斯大鼠OFL 的研究中，研究者利用贝叶斯统计方法和格兰杰因果关系量化大鼠的僵住行为（freezing，FZ）反应，发现该行为不存在性别差异［11］。这一结果得到相关研究支持［12-14］。然而，Pisansky等［15］研究表明，面对陌生的同类，雌性较雄性小鼠僵住时间更长；Mikosz 等［16］也发现，与经历过恐惧条件反射的同类进行社会互动（social interaction，SI）对雄性大鼠的双向回避学习有正向调节作用，但对雌性无影响，说明OFL 中的回避行为存在性别差异。这些结果表明，观察性恐惧的行为表达在雄性和雌性之间是不同的，目前的研究对于OFL 是否存在性别差异并未达成共识［17］，而这些差异可能是由于采用了不同的行为范式，如FZ、回避反应或SI［18］等，提示在进行性别比较时综合考虑多种恐惧评价指标的重要性。

演示动物的情绪状态通过社会传递诱发观察者的恐惧，而OFL 类的啮齿动物情绪转化模型需要捕捉社会情绪传递的各个方面，包括获得恐惧后伴随的焦虑和回避等行为表现。用于评估OFL 的任务类型是根据研究者为了探究动物恐惧状态下某种行为表现而选定的，例如，FZ［18-19］代表动物在恐惧状态下的被动防御，主动回避行为［20-21］代表动物在恐惧状态下的主动防御，SI 行为［16，22］代表动物恐惧情绪的社会传递等。由于3种行为的性别差异测试结果并不完全一致，导致难以通过单一行为反映OFL 的性别差异。因此如何将多种行为结果进行整合，并且能通过1 个复合值去总体评价OFL 的性别差异是急需解决的问题。

Z-score 是一种通常用于临床研究［23］和量化动物行为［24-26］的数值计算方法，在动物行为量化研究中，使用该方法可将多个行为变量进行整合后获得一个复合变量（即综合情绪Z 值），从而代表一系列行为在情绪方面的整体描述。例如Huynh 等［27］在研究性别因素和光周期对大鼠焦虑和抑郁样行为的影响时，通过束缚应激后对大鼠进行了旷场、高架十字迷宫、强迫游泳和蔗糖偏好实验，在单个行为实验中得到的性别差异的结果不同，但采用Z-score 整合大鼠各项焦虑或抑郁样行为测试结果，根据综合情绪Z值来推断大鼠的总体状态发现，光照下，慢性应激会增加雄性大鼠的抑郁样行为，但雌性不会。一般认为，使用情绪Z-score 归一化的行为参数都具有同样的权重，因此小鼠在OFL 模型中的FZ、回避和SI 3种行为整合后是否存在性别差异，目前尚不清楚。

本研究采用实验室前期建立的OFL模型［28］，通过观察小鼠的FZ、旷场回避（open filed avoidance，OFA）和SI 行为综合评价小鼠的OFL，引入Z-score 归一化法整合雌性和雄性小鼠的行为参数，以综合情绪Z 值评价和比较不同性别小鼠的恐惧反应。此外，进一步通过去势手术消除雌激素的影响，对比雌性去势小鼠与雌性假手术小鼠在OFL中恐惧反应特征。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 小鼠，雄性（6 周，18～20 g）84只和雌性（6周，15～17 g）96只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。每笼4 只，饲养5 周，饲养环境湿度40%～60%，温度24～26 ℃，光照和黑暗12 h 循环（光照时间8∶00～20∶00），小鼠自由摄食饮水。实验前将同笼小鼠随机分为演示鼠和观察鼠，所有实验均以观察鼠作为研究对象。动物饲养及实验操作过程均严格遵守军事医学研究院实验动物中心动物饲养和使用委员会的规定（动物伦理审批号：IACUC-DWZX-2022-929）。

1.2 主要仪器

旷场行为箱（型号：XR-XZ301）和导电金属网，上海欣软信息科技有限公司；高清USB 摄像头，海康威视数字技术股份有限公司；Anymaze 行为学分析软件，美国Stoelting 公司；可吸收外科缝合线（带针），上海浦东金环医疗用品股份有限公司。

1.3 小鼠观察性恐惧习得范式

实验室前期设计的行为装置（40 cm×40 cm×40 cm），左上角有一圆柱形镂空透明塑料演示笼（直径10 cm，高20 cm）用以固定演示鼠，演示笼下有导电金属网。采用高清USB 摄像头对行为装置内部进行视频记录（图1A）。

实验小鼠经同笼饲养5 周后进行OFL 实验。实验前，至少提前30 min 将小鼠置于实验环境，以减轻其应激反应。实验第1 天包括3 个阶段：①适应阶段，演示笼中无演示鼠，将观察鼠放入行为装置的中心位置适应环境4 min；②交互阶段，将同笼演示鼠放入演示笼中，允许观察鼠自由探索4 min；③OFL训练阶段，将观察鼠分为模型组和对照组，将同笼演示鼠放入演示笼中，模型组观察鼠目睹演示鼠每隔10 s 遭受1 次足底电击（1 mA，2 s），持续4 min；对照组观察鼠观察未受足底电击的演示鼠。训练结束后，将小鼠放回原笼，24 h 后进行观察性恐惧回忆测试。测试时，将观察鼠放回原行为装置中（此阶段演示笼中无演示鼠），持续观察4 min（图1B，表1）。用Anymaze软件分别记录并分析观察性恐惧训练阶段和恐惧回忆阶段的FZ，OFA 和SI行为。

1.3.1 僵住行为

FZ 表现为除呼吸运动外全身其余的肌肉运动均消失，记录观察鼠在上述行为装置中的僵住时间，以评估其FZ。

1.3.2 旷场回避行为

记录观察鼠在角落区域（角落区面积为10 cm×10 cm，图1A）的停留时间和运动路程百分比，以评估其回避行为。角落区运动路程百分比（%）=角落区的运动路程/旷场（包括角落区）总运动路程×100%。

1.3.3 社会交互行为

记录观察鼠在交互区域（距离演示笼2 cm范围内，图1A）的停留时间和进入次数，以评估其SI行为。

1.4 小鼠OFL综合恐惧情绪分数计算

采用Guilloux 等［24］报道的Z-score 归一化方法，以雌性对照组观察鼠的观察性恐惧反应作为情绪基线，整合OFL训练阶段和24 h后恐惧回忆阶段观察鼠FZ，SI 和OFA 行为指标的综合恐惧情绪分数（即综合情绪Z值）。分为以下3步进行：

首先，采用式①对各行为指标的数据进行Z-score归一化处理，计算Z值：

式中X表示雌、雄个体行为观测数据，μ表示雌性对照组某一行为数据的均值，SD表示雌性对照组某一行为数据的标准差。

其次，计算3 种行为的整合Z 值，分别以Z-FZ，Z-SI和Z-OFA 表示。其中Z-FZ 即由式①计算得到的Z值，Z-OFA和Z-SI分别是OFA和SI行为中2项行为观察指标Z值的平均值。

最后，采用式②计算3 种行为整合得到的综合情绪Z值：

1.5 雌鼠双侧卵巢切除术（ovariectomy，OVX）

根据文献［29］方法进行OVX 建立雌性去势小鼠模型。雌性小鼠采用戊巴比妥钠（80 mg·kg-1，ip）麻醉后将背部毛发剃除并用75%乙醇擦拭消毒；在无菌条件下，在背部中线下1/3 处两侧皮肤和肌肉组织中做一个腹膜后切口；分离脂肪团，摘除卵巢，结扎子宫角；术后将子宫角送回腹腔，用可吸收缝合线将肌肉和皮肤切口依次缝合。同法摘除另一侧卵巢。假手术组只剪取卵巢周围的脂肪组织而不摘除卵巢，其余操作与去势组一致。小鼠术后恢复1 周后进行OFL 实验（方法同1.3）。将去势小鼠分为去势对照组（行去势手术后目睹未遭受电击的同类）和去势模型组（行去势手术后目睹同类遭受电击）；假手术小鼠分为假手术对照组（假手术后目睹未遭受电击的同类）和假手术模型组（假手术后目睹同类遭受电击）。

Fig.1 Procedures of observational fear learning（OFL）in mice. A and B：diagram of the apparatus used for observational fear learning and the scheme of the behavioral assay.

Tab.1 Behavioral parameters in training/24 h fear retrieval stage of OFL in mice

1.6 统计学分析

各组观察鼠的所有行为结果数据均用Anymaze分析软件采集，以±s表示，数据分析和图形制作均使用GraphPad Prism 9.3.0 软件，使用Shapiro-Wilk test 对数据进行正态性分析，采用单因素或双因素方差分析，两组间比较采用Sidak 多重比较检验或非配对t检验进行统计分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌、雄小鼠在OFL模型中的行为表现

2.1.1 僵住行为

训练阶段实验结果（图2A）表明，与同性别对照组相比，模型组雌、雄性观察鼠的僵住时间均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），并且模型组雌、雄性之间僵住时间无性别差异，提示雌、雄观察鼠在训练阶段目睹同类遭受电击均可诱发观察性恐惧情绪，且在僵住时间上的表现并无差异。在24 h 后观察性恐惧回忆阶段（图2B），与同性别对照组相比，模型组雄性僵住时间仍较长（P＜0.01），而雌性僵住时间无显著差异，雄性比雌性观察性恐惧反应持续时间更长（P＜0.01），说明OFL训练后，模型组雌、雄观察鼠FZ行为存在明显的性别差异。

Fig.2 Freezing time（FT）in FZ. See Fig.1 for the mouse treatment. A：raw data of FT in the training stage；B：raw data of FT in the 24 h fear retrieval stage.±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）.＊P＜0.05，compared with the female control group；##P＜0.01，compared with the male control group；ΔΔP＜0.01，compared with the female model group.

2.1.2 旷场回避行为

训练阶段实验结果（图3A1和B1）表明，与同性别对照组相比，模型组雌、雄小鼠在角落区的停留时间均显著延长（P＜0.01）。此外，模型组雌性在角落区运动路程百分比较同性别对照组显著增加（P＜0.01），但模型组雄性与同性别对照组无显著差异。以各组小鼠在角落区停留时间和运动路程百分比的Z 值作图（图3A2 和B2）显示，Z-score 归一化未改变各组间的统计学差异。在24 h 后观察性恐惧回忆阶段（图3C1 和D1），模型组雌、雄鼠在角落区停留时间和运动路程百分比较同性别对照组均无显著差异。该阶段2 个行为参数经Z-score 归一化后，各组间统计分析结果与归一化前一致（图3C2和D2）。

Fig.3 Avoidance behavior and its Z-scores in OFA. See Fig.1 for the mouse treatment. A1 and B1：raw data of CT and CDR in the training stage. A2 and B2：normalization of Z-score for the Z-CT and Z-CDR in the training stage. C1 and D1：raw data of CT and CDR in the 24 h fear retrieval stage. C2 and D2：normalization of Z-score for the Z-CT and Z-CDR in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊＊P＜0.01，compared with the female control group；##P＜0.01，compared with the male control group.

2.1.3 社会交互行为

观察性恐惧训练阶段数据（图4A1和B1）表明，与雄性对照组相比，模型组雄性观察鼠的交互次数无显著差异，而模型组雌性交互次数较同性别对照组显著减少（P＜0.01）。与同性别对照组相比，模型组雌、雄观察鼠交互时间均无明显差异，模型组雌、雄之间也无性别差异。分别将交互时间和交互次数数据进行Z-score 归一化并统计分析（图4A2 和B2）显示，Z-score 归一化前、后数据统计学分析结果无改变。24 h 后恐惧回忆阶段（图4C1 和D1），模型组雄性观察鼠的交互次数较模型组雌性明显减少（P＜0.01），但交互时间无显著差异。经Z-score归一化处理（图4C2 和D2）后，数据统计分析结果同样无改变。

Fig.4 Social behavior and its Z-scores in Sl. See Fig.1 for the mouse treatment. A1 and B1：raw data of IE and IT in the training stage. A2 and B2：normalization of Z-score for the Z-IE and Z-IT in the training stage. C1 and D1：raw data of IE and IT in in the 24 h fear retrieval stage. C2 and D2：normalization of Z-score for the Z-IE and Z-IT in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊＊P＜0.01，compared with the female control group；ΔΔP＜0.01，compared with the female model group.

2.2 雌、雄小鼠在OFL训练和24 h后回忆阶段的综合情绪Z值

在训练阶段，将3 种行为进一步整合，以Z-FZ，Z-SI 和Z-OFA 值作图并进行统计分析（图5A1-3）发现，与同性别对照组相比，模型组雌、雄性Z-FZ值均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），且模型组雌、雄性别之间未见显著差异。模型组雌性的社交回避（Z-SI值）显著增加（P＜0.05），但雄性不明显，两性别之间无显著差异。与同性别对照组相比，模型组雌（P＜0.01）、雄（P＜0.05）鼠OFA 行为Z-OFA 值均明显增加，但两性别之间的无显著差异。基于3 种行为测试权重相同的前提，将Z-FZ，Z-SI 和Z-OFA 值综合平均得到综合情绪Z 值（图5B），数据分析结果显示，在训练阶段模型组雌、雄观察鼠的综合情绪Z值均显著高于其同性别对照组（P＜0.01），但模型组雌、雄之间未见性别差异。同法，将24 h 后恐惧回忆阶段的3 种行为参数Z-score 归一化后得到的整合Z 值（图5C1-3）和综合情绪Z 值（图5D）表明，模型组雌性小鼠的恐惧反应与其同性别对照组无显著差异，但模型组雄性与其同性别对照组间存在显著差异（P＜0.05），且显著高于模型组雌性（P＜0.01）。以上结果表明，雌、雄小鼠均可习得观察性恐惧，但雄性小鼠OFL持续时间比雌性小鼠更长。

Fig.5 lntegrated emotionality Z-scores in mice on OFL. See Fig.1 for the mouse treatment. A1-3：Z-FZ，Z-SI，and Z-OFA were calculated by averaging individual Z-scores；B：averaged to obtain an integrated Z-emotionality in the tarining stage；C1-3：Z-24 h FZ，Z-24 h SI，and Z-24 h OFA were calculated by averaging individual Z-scores；D：averaged to obtain an integrated Z-emotionality in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=20/20（female/male in control group），n=28/22（female/male in model group）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the female control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the male control group；ΔΔP＜0.05，compared with the female model group.

2.3 去势雌性小鼠在OFL 中的行为和综合情绪Z值

在训练阶段，FZ 结果（图6A1）表明，与假手术对照组比较，假手术模型组的僵住时间显著增加（P＜0.05），而OVX 模型组的僵住时间较OVX 对照组也明显增加（P＜0.05）；SI 行为数据表明，假手术模型组较假手术对照组的交互次数显著降低（P＜0.05，图6A2-1），但假手术模型组与假手术对照组、OVX 模型组与OVX 对照组的交互时间均无显著差异（图6A2-2）；OFA 行为数据显示，假手术模型组较假手术对照组的角落停留时间显著增加（P＜0.01，图6A3-1），而OVX 模型组较OVX 对照组无显著差异。与假手术对照组相比，假手术模型组的角落区运动路程百分比均显著增加（P＜0.05），且OVX 模型组较OVX 对照组也显著增加（P＜0.05，图6A3-2）。将3种行为整合后得到去势小鼠在训练阶段的恐惧反应综合情绪Z 值（图6B）显示，与假手术对照组相比，假手术模型组的观察性恐惧反应显著增加（P＜0.01），且OVX 模型组的观察性恐惧反应也显著高于OVX 对照组（P＜0.05），但OVX 模型组与假手术模型组之间无差异，说明雌性去势小鼠在目睹熟悉同伴遭受电击时也会习得观察性恐惧，且这种恐惧习得与假手术小鼠无差异。在24 h 后观察性恐惧回忆阶段，FZ 数据（图6C1）显示，OVX 模型组较OVX对照组僵住时间显著增加（P＜0.01），且OVX 模型组较假手术模型组僵住时间也显著延长（P＜0.01）；SI行为数据表明，假手术模型组与假手术对照组、OVX模型组与OVX对照组的交互次数均无显著差异（图6C2-1），但OVX 模型组较假手术模型组的交互时间显著缩短（P＜0.01，图6C2-2）；OFA行为数据显示，假手术模型组与假手术对照组、OVX模型组与OVX对照组的角落停留时间（图6C3-1）和角落区运动路程百分比（图6C3-2）均无显著差异。去势小鼠在24 h 后恐惧回忆阶段的综合情绪Z 值（图6D）显示，假手术模型组的观察性恐惧反应较假手术对照组无显著差异，而OVX模型组仍显著高于OVX 对照组（P＜0.05），且OVX 模型组的观察性恐惧反应较假手术模型组也显著升高（P＜0.01）。提示去势后的雌性小鼠OFL 与雄性小鼠类似，性激素在OFL的性别差异中可能发挥重要的调节作用。

Fig.6 lntegrated emotionality Z-scores in ovariectomized mice on OFL. The mice that witnessed their conspecifics without electric shock after sham ovariectomy were named the sham control group，while the sham model group was the sham-ovariectomized mice which witnessed their conspecifics suffering electric shock. The OVX control group was the ovariectomized mice that witnessed their conspecifics without electric shock，while the OVX model group was the ovariectomized mice which witnessed their conspecifics suffering electric shock. A1：row data of FT in the training stage；A2：row data from SI in the training stage included IE（A2-1）and IT（A2-2）；A3：row data from OFA in the training stage included CT（A3-1）and CDR（A3-2）；B：the integrated Z-emotionality in the training stage；C1：row data of FT in the 24 h fear retrieval stage；C2：row data from SI in the 24 h fear retrieval stage included 24 h-IE（C2-1）and 24 h-IT（C2-2）；C3：row data from OFA in the 24 h fear retrieval stage included 24 h-CT（C3-1）and 24 h-CDR（C3-2）；D：the integrated Z-emotionality in the 24 h fear retrieval stage. ±s，n=12/20（OVX/sham in control group），n=16/28（OVX/sham in model group）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the sham control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the OVX control group；ΔΔP＜0.01，compared with the sham model group.

3 讨论

第5版《精神障碍诊断与统计手册》（DSM-5）强调了精神创伤的危害性，创伤后痛苦不仅局限于直接受害者，目睹创伤情景或获悉发生于他人的悲剧，甚至对创伤事件的细节有明确的了解，都被证明会在不同程度上引起严重的、持续的无助、恐惧和消极认知，但这类通过社会观察获得的精神创伤往往容易被忽略，最终发展为精神障碍疾病［6］。与人类相似，啮齿类动物也可通过社会观察间接习得恐惧，OFL 范式是研究啮齿类动物恐惧社会传递的有效行为范式，其中观察鼠是无先前痛苦经历的小鼠，仅仅通过目睹演示鼠遭受电击痛苦而产生了与演示鼠类似的恐惧行为反应如FZ，该行为是公认的动物恐惧反应评价指标［9，30-31］。然而，当啮齿类动物接受恐惧的社会信号时，行为学测试通常会产生多种行为变量，除僵住不动以外，还包括快速蹿行［32］、疼痛发声［33-34］、排便［35］、回避［20-21］和SI［16，22］等行为。已有文献表明，恐惧的行为表达存在性别差异［36-37］，如雌性比雄性表现出更少的FZ［32，38］。因此，在进行性别比较时使用多种恐惧评价指标十分重要。

本研究发现，在OFL 训练阶段，雌、雄小鼠的FZ，OFA 和SI行为均无显著差异，而在24 h后恐惧回忆阶段，与雌鼠相比，雄鼠的FZ 显著增加、OFA无差异、SI显著降低。3种行为测量结果并不一致。为了将多个相关的行为变量综合成更有意义的信息，有必要整合多个数据，对某个情绪维度或动机系统的总体描述。

本研究参考Shi 等［28］的研究方法引入Z-score归一化整合3 项行为测试结果，以综合情绪Z 值反映不同性别小鼠的恐惧反应。结果发现，在OFL中，雌雄小鼠均能在训练阶段通过目睹同类遭受痛苦而获得恐惧，但雄性小鼠在24 h 后恐惧回忆阶段比雌性表现出更高的恐惧反应，说明雄性小鼠比雌性更容易形成持久的恐惧记忆。这一差异的原因可能是雌、雄小鼠对观察性恐惧的情景学习能力存在差异。这一现象也得到了前人研究的支持，即雄性表现出更强的情境恐惧［40-43］。

使用综合情绪Z值可进一步探究行为表型与潜在分子机制之间的关联［26］。性腺类固醇激素受体的基因调节通常被认为是研究性别差异的首选，月经周期和更年期神经精神症状的波动，都表明雌激素在神经精神障碍疾病中可能发挥作用［44-45］。尽管本研究缺乏对性腺类固醇激素的检测，但本研究发现，去势后的雌鼠在OFL 中的行为表现以及综合情绪Z值与雄鼠类似，可能是性激素如雌激素对神经内分泌或中枢神经系统发挥调节作用的结果。下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴在调节动物应对应激的能力中起着重要的作用，而HPA 轴功能的性别差异可能部分源于性腺类固醇激素环境的差异。在啮齿类动物中，基础和应激诱导的肾上腺糖皮质激素分泌，雌性大于雄性，雌激素诱导高水平的HPA 轴活性，而卵巢切除术后，小鼠静息时血浆和肾上腺组织中皮质酮水平较低［46-47］。此外，雌激素还可以通过影响与压力反应有关的脑区（杏仁核、海马、导水管周围灰质、内侧前额叶皮质和前扣带皮质等）来调节神经内分泌和情绪反应［48-50］。雌激素对HPA 轴及压力脑区的调节表明，类似的压力暴露可能由于性激素的差异导致男性和女性的情绪反应出现不同的结果，相关机制和潜在干预措施值得深入研究。

综上所述，雄鼠的OFL 反应比雌鼠更持久，且去势雌鼠的OFL反应与雄鼠相似，说明OFL确实存在性别差异，且这种差异可能与性激素有关。本研究数据有利于加深OFL 领域在性别差异的理解，而未来对这种性别差异背后的分子和神经生物学机制的进一步研究，将为优化临床治疗方案提供建议，也将推进诊断和治疗中以性别为导向的个性化医疗的发展。