土茯苓总黄酮对兔离体胸主动脉环的舒张作用及机制

吴文斌，周江峰，周 荧，潘永明，屠 珏，蔡兆伟，王德军

（1.浙江中医药大学中医药科学院动物实验研究中心，浙江 杭州 310053；2.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203）

高血压是一种以收缩压或舒张压异常升高为特征的常见心血管疾病，是诱发心脑血管疾病最常见的风险因素。血管的舒缩张力失常是引起高血压的一大重要影响因素，与血管内皮细胞、平滑肌细胞和血液中的血管舒缩因子的浓度直接相关［1］。血管内皮细胞参与对平滑肌的保护，并释放内皮衍生舒缩因子和其他血管舒缩因子，共同参与对血管平滑肌细胞的调控［2］。一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）是一种内皮衍生舒张因子，从内皮扩散到平滑肌，诱导舒张［3］。另外，血管平滑肌还会受到来自细胞外的刺激，开放受体调控钙离子通道或电压依赖性钙离子通道（voltage dependent calcium channel，VDCC），导致胞外钙离子内流或肌浆网钙离子外流，激活肌球蛋白轻链磷酸化而导致血管收缩，反之则介导血管舒张［4-5］。然而，尽管临床治疗高血压药物种类繁多，但均有不良反应，因此仍需研发新型的抗高血压药物［6］。

传统中药具有药效好、副作用低等特点，被广泛用于慢性疾病的治疗。土茯苓是百合科植物光叶菝葜（SmilaxglabraRoxb.）的干燥根茎，性平味甘，具有解毒祛湿、通利关节等功效［7］。现代药理研究表明，土茯苓中的活性成分具有抗炎、抗氧化和保护心血管等作用［8］。本课题组前期研究表明，土茯苓具有血压调节作用，并可能与NO 有关［9］。本研究利用大孔吸附树脂法提取土茯苓中的主要黄酮类活性成分，命名为土茯苓总黄酮（Smilaxglabraflavonoids，SGF），通过离体兔胸主动脉环实验研究SGF 对血管舒缩活性的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

SGF 来源及制备：土茯苓，购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，批号18062524，由浙江中医药大学中医药科学院药学院科研中心公共平台委托提取，项目编号2018010006。取适量土茯苓粉碎至40～60 mm，用60%乙醇作提取剂，100 V，闪式提取2 次，经旋转蒸发仪浓缩，高速冷冻离心2830×g，10 min，取上清液，稀释后利用大孔吸附树脂提取法提取洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至浸提膏，冷冻干燥后得到SGF。采用紫外分光光度法检测总黄酮含量达92.59%。用生理盐水配制成浓度为25 g·L-1的SGF 母液。大孔吸附树脂，购自安徽三星树脂有限公司，型号HP-20，批号：20180728。β2肾上腺素能受体阻滞剂ICI118551（盐酸盐），美国MCE 公司；内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME），美国Sigma 公司；重酒石酸去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）注射液，杭州远大医药有限公司；盐酸去甲肾上腺素（norepinephrine，NE），阿拉丁公司；氯化乙酰胆碱，上海麦克林生化科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

Krebs-Henseleit（KH）生理溶液（mmol·L-1）：NaCl 118.3，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325，D-葡萄糖11，CaCl22.5，超声促溶；无钙KH 液除了将CaCl22.5 mmol·L-1换成EDTA 0.1 mmol·L-1外，其他成分同KH液。

SQG-4 型四腔器官浴槽系统和HSS-1（B）型恒温浴槽，成都仪器厂；MedLab-U/8c 生物信号采集处理系统，南京美易科技有限公司；JZ101型张力换能器，北京新航兴业科贸有限公司。

1.2 动物和离体兔胸主动脉环制备

清洁级新西兰白兔43只，3～4月龄，2.5～3.5 kg，雌雄兼用（杭州余杭科联兔业专业合作社），实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2017-0004；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心普通级兔实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0012，室温20～22 ℃，相对湿度40%～60%，12 h 明暗交替，自由摄食饮水。所有实验步骤均经浙江中医药大学动物福利与伦理审查委员会批准（编号：IACUC-20221008-02）。

根据文献［10］所述，将兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠（35 mg·kg-1）后，快速剪开胸腔取出胸主动脉，置预冷的95% O2∶5% CO2混合气饱和的KH 液中。小心去除血管周围的脂肪与结缔组织，并切成约4 mm 胸主动脉环，并用湿棉签轻轻摩擦胸主动脉环内表面以去除内皮。将一对不锈钢钩穿过胸主动脉环段中间将其悬挂，血管张力可通过张力换能器记录于生物信号采集处理系统。将胸主动脉环浸入6 mL KH 液浴槽中并持续通入95% O2∶5% CO2混合气，水浴维持37℃。实验前用2.0 g 张力平衡1 h，每30 min 更换1次KH液。开始正式实验前，用KCl 60 mmol·L-1刺激胸主动脉环收缩，达最大张力后洗脱，重复3次。随后使用PE 1 μmol·L-1刺激胸主动脉环收缩，达最大张力后使用氯化乙酰胆碱20 μmol·L-1诱导胸主动脉环舒张。舒张程度＞60%认为是内皮完整胸主动脉环，＜20%则认为是去内皮胸主动脉环［11］。

1.3 实验分组

1.3.1 内皮完整胸主动脉环

取1.2 制备的内皮完整胸主动脉环，进行如下分组处理：①分为SGF 组和溶剂对照组。SGF 组用KCl 60 mmol·L-1诱导胸主动脉环收缩，达最大张力且处于平台期后，采用累计加药的方法，每6 min 加入不同体积SGF 溶液，使SGF 终浓度达15.625，31.25，62.5，125 和250 mg·L-1；溶剂对照组加入等体积生理盐水代替SGF 溶液，其余操作与SGF 组一致。②分为SGF 组和溶剂对照组。SGF 组用PE 或NE 1 μmol·L-1分别诱导胸主动脉环收缩，达最大张力且处于平台期后，采用累计加药的方法，每6 min加不同体积SGF溶液，使SGF终浓度达15.625，31.25，62.5，125，250 和500 mg·L-1；溶剂对照组加等体积生理盐水代替SGF 溶液，其余操作与SGF 组一致。③分为L-NAME 组及其溶剂对照组和ICI1185513 组及其溶剂对照组。L-NAME组和ICI1185513组用L-NAME 100 μmol·L-1或ICI118551 0.1 μmol·L-1分别预处理30 min，随后加NE 1 μmol·L-1诱导胸主动脉环收缩，达最大张力且处于平台期后，采用累计加药的方法，每6 min加不同体积SGF 溶液，使其终浓度达15.625，31.25，62.5，125，250 和500 mg·L-1；溶剂对照组加等量生理盐水分别代替L-NAME 或ICI118551，其余操作与L-NAME组或ICI118551组一致。

1.3.2 去内皮胸主动脉环

取1.2 制备的去内皮胸主动脉环，进行如下分组处理：①分为SGF 组和溶剂对照组。SGF 组用PE 或NE 1 μmol·L-1分别诱导胸主动脉环收缩，达最大张力且处于平台期后，采用累计加药方法，每6 min 加不同体积的SGF 溶液，使其终浓度达15.625，31.25，62.5，125 和250 mg·L-1；溶剂对照组加等体积生理盐水代替SGF 溶液，其余操作与SGF 组一致。②分为SGF 组和溶剂对照组。SGF组胸主动脉环在KH 液中稳定1.5 h，换成无钙KH液平衡20 min，用KCl 60 mmol·L-1诱导胸主动脉环去极化，同步加SGF 500 mg·L-1预处理20 min，达最大张力且处于平台期后，采用累计加药方法，每6 min加不同体积的CaCl2溶液，使其终浓度达0.15，0.3，0.6，1.2和2.4 mmol·L-1；溶剂对照组加等体积生理盐水代替SGF 溶液，其余操作与SGF组一致。

1.4 血管张力计算

取1.3.1①②③和1.3.2①②分组处理的胸主动脉环，利用MedLab-U/8c生物信号采集处理系统将血管张力信号转换为电信号，记录各时间点血管张力变化，计算胸主动脉环舒张率，并以各组收缩剂上升的张力为100%绘制浓度-反应曲线。舒张率（%）=（给药前血管张力-给药后血管张力）/（给药前血管张力-静息血管张力）×100%，收缩率（%）=1-（给药前血管张力-给药后血管张力）/（给药前血管张力-静息血管张力）×100%。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 SGF 对KCl 预收缩内皮完整胸主动脉环张力的影响

如图1 所示，SGF 15.625～250 mg·L-1对KCl 60 mmol·L-1预收缩内皮完整胸主动脉环有轻微的舒张作用，但舒张率无统计学差异。

Fig.1 Effect of Smilax glabra flavonoids（SGF）on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with potassium chloride KCl 60 mmol·L-1.KCl 60 mmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 min. SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-250 mg·L-1.±s，n=8.

2.2 SGF 对PE 或NE 预收缩内皮完整胸主动脉环张力的影响

如图2 所示，SGF 62.5～500 mg·L-1对PE 或NE 1 μmol·L-1预收缩内皮完整胸主动脉环均有明显的舒张作用，最大舒张率达（56±12）%和（76±13）%（P＜0.01）。在SGF 15.625～62.5 mg·L-1浓度范围内，其舒张率随浓度上升而增加，并在浓度62.5～250 mg·L-1内达到平台期。在SGF 500 mg·L-1作用下，不论以PE 或NE 作为收缩剂，胸主动脉环舒张率均下降，舒张率分别为（40±10）%和（46±15）%。

Fig.2 Effect of SGF on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with phenylephrine（PE）or norepinephrine（NE）. PE 1 μmol·L-1 or NE 1 μmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 min，respectively.SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-500 mg·L-1. ±s，n=6-8. ＊＊P＜0.01，compared with NE group；##P＜0.01，compared with PE group.

2.3 L-NAME 预处理对SGF 在内皮完整胸主动脉环中舒张作用的影响

图3 结果显示，与溶剂对照组相比，L-NAME 显著降低SGF 31.25～500 mg·L-1诱导的胸主动脉环舒张率（P＜0.01）。

2.4 lCl118551 预处理对SGF 在内皮完整胸主动脉环中舒张作用的影响

如图4 所示，与溶剂对照组相比，ICI118551 显著降低SGF 62.5～500 mg·L-1诱导的胸主动脉环舒张率（P＜0.01）。此外，ICI118551 组舒张率呈现先升高后下降的趋势，与溶剂对照组一致，提示SGF可能与β2肾上腺素受体阻滞剂存在协同作用。

Fig. 4 Effect of β2-adrenoceptor blocker lCl118551 pretreatment on SGF-induced vasodilation on thoracic aortic rings with intact endothelium pretreated with NE.β2-adrenoceptor blocker ICI118551 0.1 μmol·L-1 was added to thoracic aortic rings for 30 min for pretreatment. NE 1 μmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 10 minutes.SGF was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of SGF 15.625-500 mg·L-1. ±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with SGF+NE+saline group.

2.5 SGF 对PE 或NE 处理去内皮胸主动脉环张力的影响

如图5 所示，胸主动脉环去除内皮后，无论是NE 还是PE 作为收缩剂，SGF 组与溶剂对照组的舒张率之间均无明显差异，表明内皮可能是SGF诱导胸主动脉环舒张的重要因素。

2.6 SGF 预处理对钙离子收缩去内皮胸主动脉环张力的影响

如图6所示，CaCl2诱导胸主动脉环收缩率逐步升高，而采用SGF 500 mg·L-1预处理去内皮胸主动脉环20 min 后，CaCl20.6～2.4 mmol·L-1诱导的胸主动脉环收缩率显著下降（P＜0.01），提示SGF可能具有钙离子通道阻滞剂的作用。

Fig.6 Effect of SGF pretreatment on calcium-induced contraction on thoracic aortic rings with denuded endothelium. KCl 60 mmol·L-1 was added to pre-contract thoracic aortic rings for 20 min in a calcium-free environment，while SGF 500 mg·L-1 was added. CaCl2 was added once every 6 min，and the change of vascular tension was detected at the cumulative concentration of CaCl2 0.15-2.4 mmol·L-1. ±s，n=9. ＊＊P＜0.01，compared with CaCl2 saline+KCI group.

3 讨论

本研究发现，在内皮完整条件下，SGF 可显著诱导胸主动脉环舒张，而这种作用在去内皮或eNOS 抑制的胸主动脉环中几乎完全丧失，说明内皮舒张因子NO 在其中可能起关键作用。实验结果显示，SGF 可部分阻断Ca2+诱导的胸主动脉环收缩，说明SGF 还可能通过非内皮依赖方式舒张血管。因此，SGF 通过内皮依赖和非依赖的途径共同发挥作用，而NO依赖性诱导血管舒张可能是其主要机制。

NO 是诱导血管舒张的重要激活剂。前期有研究在肾性高血压大鼠上发现，土茯苓水提物可显著改善高血压大鼠的收缩压和舒张压，并能增加NO水平［9］。在本研究中，去除血管内皮或添加eNOS抑制剂L-NAME 可以显著阻断SGF 诱导的舒张作用，进一步说明NO可能是SGF发挥作用的主要内皮舒张因子。此外，本研究发现SGF 500 mg·L-1对胸主动脉环的舒张作用减弱。先前已有研究表明，土茯苓提取物赤土茯苓苷具有β肾上腺素能受体阻滞样作用［12］。考虑到血管上主要分布β2受体，激动β2受体具有平滑肌松弛和血管舒张等作用，推测SGF 对血管的舒张作用减弱可能与β2受体抑制有关，因此本研究采用β2肾上腺素能受体阻滞剂ICI118551 进行预处理，发现ICI118551 进一步减弱了SGF 诱导的胸主动脉环舒张。然而，Tan 等［13］在利用普萘洛尔预处理离体主动脉环对白藜芦醇诱导的血管舒张作用的研究中并未出现类似的现象。因此，未来仍需明确SGF 的β2肾上腺素能受体阻滞样作用。SGF 是土茯苓的提取物，本文研究结果也进一步支持了土茯苓具有β受体阻滞样的作用。

研究证实，胸主动脉环在加入钙鳌合剂EGTA的无钙高钾KH 液中孵育后，细胞处于去极化的状态，VDCC 处于活化状态，此时加入钙离子所引起的胸主动脉环收缩主要是细胞外钙通过钙通道流入细胞内所引起［14］。已有研究表明，SGF 可以显著抑制由PE 和血管紧张素Ⅱ诱导的心肌钙离子依赖性收缩，并与兰尼碱受体相关［15］，说明SGF 在钙平衡中起到重要作用。本研究证实，SGF 500 mg·L-1对外源性CaCl2诱导的胸主动脉环收缩有抑制作用，而对KCl诱导的胸主动脉环收缩作用较弱，表明SGF 能拮抗细胞外钙的作用，因此可能具有钙离子通道阻滞剂效果。

综上所述，本研究发现SGF在内皮完整和破坏的兔离体胸主动脉环模型上通过信号通路发挥其血管舒张作用，初步揭示了SGF具有治疗高血压的潜力，但其临床作用和干预机制仍需进一步研究和探索。