飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术来源的角膜基质透镜保存方法的研究进展

熊素雅, 王 宁, 白梦天, 康海军, 林 莉,

(1. 成都中医药大学眼科学院, 四川 成都, 610075; 2. 四川省遂宁市中心医院 眼科中心, 四川 遂宁, 629000)

角膜盲发病率高居中国致盲性眼病第2位,角膜移植手术是治疗角膜盲的有效方法,但因角膜供体严重匮乏,许多角膜盲患者缺少重获光明的机会,因此寻找新的角膜供体材料成为眼科界的关注热点[1]。角膜基质透镜是角膜组织的一部分,由有序排列的胶原纤维和角膜基质细胞组成,没有血管和淋巴组织,可作为一种免疫排斥反应较小的角膜移植材料应用。研究[2-3]发现,飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(SMILE)来源的角膜基质透镜最大程度地保留了角膜组织的理化特性,学者们将其用来治疗角膜溃疡、圆锥角膜、角膜营养不良等眼科疾病,并证实其安全有效。因角膜移植术前需进行传染病筛查、供体和受体需在同一天完成手术等因素限制,致使大多新鲜透镜不能及时应用于临床而被丢弃。故如何保存角膜基质透镜,维持其胶原纤维结构完整性、透明度和降低免疫原性并延长其保存时间等,成为了研究热点。本文就SMILE来源的角膜基质透镜的保存方法的研究进展进行综述。

1 超低温冷冻保存

超低温冷冻保存技术是指在活细胞、角膜组织或其他生物样本中添加冷冻保护剂(如二甲亚砜、丙二醇和聚乙二醇等),使其在冷冻过程中免受或减少一系列低温损伤(冰晶损伤、渗透损伤和溶质损伤等)的影响,并通过缓慢冷冻、快速冷冻或玻璃化方法将样本降至超低温(-80 ℃或-196 ℃)进行保存,在需要的时候,以适当的方法复温、解冻,并去除冷冻保护剂进行使用[4-5]。在超低温环境中,细胞生长活动及物质代谢几乎停止,可避免代谢产物积聚所带来的毒性作用,也可抑制微生物的生长繁殖,故超低温冷冻保存法在医学上运用广泛[4]。有研究证实,超低温冷冻保存角膜基质透镜有效可行, MOHAMED-NORIEGA K等[6]将-80 ℃下保存1个月的透镜和新鲜透镜进行对比,发现2组的胶原纤维都保存完好,且存在有活性的角质细胞,2组中分离出的角质细胞进行体外培养后的细胞形态和增殖率没有显著差异,证实-80 ℃冷冻保存1个月的透镜与新鲜角膜组织相似。韦琦等[7]对比观察-80 ℃中保存1、24、60及84个月的透镜,发现随着保存时间延长,胶原排列逐渐紊乱、细胞变形皱缩明显,但各组的透光率及凋亡率无显著差异,说明-80 ℃可长期保存透镜。不过该研究尚未明确透镜胶原纤维结构发生变化的时间节点,以及缺乏将长期保存的透镜用于临床治疗的相关研究。RIAU A K等[8]发现在-196 ℃下,短期(3个月)和长期保存(12个月)的透镜较新鲜透镜透明度显著降低,之后将冷冻保存的透镜植入兔角膜中,随访观察16周发现2组均未出现明显的不良反应及炎症反应,且角膜透明度均接近术前,提示-196 ℃长期冷冻保存透镜可行。研究[9-11]表明,植入经超低温冷冻保存的透镜或新鲜透镜,在后期的伤口愈合过程并无显著差异,证实再植入超低温冷冻保存的透镜治疗部分眼部疾病安全有效。高颖等[12]将-80 ℃下保存30 d以上的透镜用于治疗3例角膜变性和2例角膜溃疡患者,术后随访6个月,发现透镜植片与植床均贴合良好,且植片保持透明,无感染及排斥反应等并发症发生。上述研究均表明,将超低温冷冻保存的角膜透镜组织用于临床安全可行,且能够保持角膜组织的透明性。

但也有学者[13]提出,该技术本身会影响组织的微观结构,对将超低温冷冻保存的透镜用于眼科疾病的治疗存在疑虑,目前还缺乏关于移植角膜基质透镜的远期并发症的相关研究。RIAU A K等[14]使用与MOHAMED-NORIEGA K等[6]相同的方法保存透镜,发现1个月后透镜出现组织水肿及清晰度降低,认为可能与透镜内的液体平衡改变有关,同时将其植入灵长类动物眼中,出现短期角膜水肿,推测人类也可能会出现类似情况,故为避免此现象影响透镜临床应用,建议超低温保存的时间尽量控制在1个月以内。此外,超低温冷冻保存法所需设备昂贵、存储过程复杂以及对技术人员要求高,导致该方法在基层医院开展受限,因此需要优化透镜的保存,以便提高透镜的利用率。

2 介质保存

为降低保存透镜的成本并优化存储过程,有研究尝试用角膜活性中期保存液(DX液)、甘油、硅油和变色硅胶等不同介质来保存角膜基质透镜,并取得了良好效果,但不同保存介质各有优缺点,实际应用中可根据不同需求进行选择。DX液由山东省眼科研究所自主研制,以细胞培养基为基础液,添加了皮质类固醇,与Optisol液相比,配制简单、价格低廉,可以降低角膜组织保存过程中的代谢,但有效期短(为配制后1周)[15]。甘油具有优异的脱水和抗菌特性,联合低温保存时,可维持组织的胶原板层结构并去除生物源性[16], 因此被认为是一种理想的透镜保存介质,但较适合1个月内的短期保存。硅油具有无毒、不挥发、疏水性和化学性质稳定等一系列优异的理化性质,可以与外界环境达到很好的隔离效果,因此有研究[17]用硅油作为介质来保存透镜,但存在从硅油取出透镜洗涤时不易洗净的问题。变色硅胶可去除角膜组织中的水分、防止细胞酶失活和抑制细胞自溶,从而保持角膜组织的完整性[18]。ROMANO V等[19]将在室温下用硅胶保存2周的角膜基质复水后,发现基质透镜仍保留其分子和生物力学特性,建议用此方法保存角膜内皮细胞计数低的供体或角膜内皮移植术等手术后剩余的角膜组织,以便后期用于深板层角膜移植术,从而增加角膜供体数量。

田乐等[16]对比观察4 ℃ DX液与-20 ℃甘油保存透镜的效果,发现DX液保存1周的透镜胶原纤维排列规则致密、细胞结构完整,而甘油中保存1 d就出现基质组织水肿、细胞核裸露,1周后细胞分布稀疏、细胞结构不完整,说明在保存时间为1周内时,DX液在维持透镜组织结构的完整性方面优于甘油。但以上研究仅进行了体外实验且保存时间较短,在眼科疾病治疗中的研究仍需进一步完善。LIANG G等[18]探索无水甘油、变色硅胶和Optisol培养基保存透镜的效果,发现2周后, Optisol培养基组在保持基质细胞活性、透镜透明度和结构完整性上优于无水甘油和变色硅胶,但Optisol培养基成本显著高于无水甘油、变色硅胶,因而限制了其在临床的广泛应用。XIA F等[17]比较无水甘油、硅油和变色硅胶对透镜透光率和超微结构的影响,发现3种保存介质均可用于透镜保存,4周后硅胶在维持透镜透光率方面效果更好,这与李文娟等[20]研究结果一致。然而该研究仅探索了透光率和超微结构变化,缺乏免疫原性和生物力学特性的相关研究。LIU Y C等[21]将透镜分别在磷酸盐缓冲液、DMEM、Optisol GS和无水甘油共4种介质中保存48 h,结果显示,各组透镜均保持较高的透明度、结构完整性和低免疫原性,说明在无法立即将透镜进行长期储存于大型实验设备前,或转运至基层医院应用时,可用此法进行临时保存48 h。研究[17-18]发现,甘油保存的透镜表现出更严重的水肿和更稀疏的胶原排列,但LIU Y C等[21]将透镜在甘油中保存时,发现透镜仍保持良好胶原纤维排列,XIA F等[17]认为这可能与其研究中相对较短的保存时间有关。

Optisol液因成本、来源和保存期等因素限制,目前在中国难以广泛应用,而甘油成本低且室温保存时能保持透镜透明度和超微结构特征,在低温下比Optisol液更具优势[22]。

3 超低温冷冻联合介质保存

尽管角膜被认为是相对免疫赦免的器官,但角膜基质透镜移植仍存在排斥风险,为探索降低抗原性的有效保存方法,许多学者借助角膜保存液、硅油、甘油等不同介质联合超低温冷冻技术来保存透镜[23]。SHANG Y F等[24]将透镜分为新鲜组、-78 ℃无水甘油保存组和0.1%十二烷基硫酸钠脱细胞组进行免疫组化、透光率检测及透射电镜观察,结果表明,-78℃无水甘油保存是减少抗原性而不破坏透镜结构和光学性能的理想方法。相关研究[25]将透镜置于室温和4、-20、-80 ℃的无水甘油中保存3个月,发现-80 ℃组的透光率接近于新鲜透镜且抗原性减少,而其他组的透光率均显著降低,提示-80 ℃无水甘油中保存为最佳方法。薛春燕等[26]用-80 ℃无水甘油中保存的透镜治疗5例角膜溃疡穿孔患者,发现仅1例真菌性角膜溃疡患者在术后1个月因植片融解坏死,而更换了新的植片,其余患者创面均愈合良好; 此外,刘娴[27]用-80 ℃无水甘油中保存的透镜联合羊膜移植治疗14例真菌性角膜溃疡患者,其术后溃疡炎症消退、前房形成良好,虽然随访时,此研究中多数植片处于半透明状,但其可有效控制炎症进展,并为后期光学性角膜移植创造条件。上述研究表明, -80 ℃下无水甘油保存的透镜单独或联合羊膜应用治疗角膜溃疡的短期疗效是安全可靠的。虽然许多研究证实,超低温冷冻联合介质保存法较单纯超低温冷冻保存及介质保存法能有效降低透镜的免疫原性,并在维持透镜透光率和胶原纤维结构完整性方面具有优势,但这些研究存在样本量较小且随访时间较短等局限,还需扩大样本量及延长随访时间观察远期疗效,以为临床应用提供参考。

4 去细胞化保存

有研究利用物理、化学和辐射等方法去除透镜的细胞成分,消除其免疫原性的同时保留细胞外基质,然后在室温下长期储存于角膜基质透镜库特定介质中,在需要时运送至医院使用,另有研究表明在透镜移植后受体自身的细胞会逐渐迁移植入透镜中,进一步揭示了去细胞化法在临床应用中的可行性[28-29]。去细胞化法因可降低透镜免疫原性和便于长期保存等优势极大提高了透镜的临床应用潜力,可能是透镜保存的研究热点。但该方法过程复杂,设备要求高,暂未广泛使用而且在中国一些患者无法负担其费用。尽管如此,随着医学技术的更迭,未来去细胞化法保存透镜仍将有广阔的发展前景。

5 营养胶囊保存

近期, ZHAO J等[30]受天然人类泪膜成分的启发,构建了1种能够维持泪膜稳态的营养水凝胶胶囊,用于中期保存角膜基质透镜,最长保存长28 d后,营养胶囊组活细胞比例、透光率及胶原纤维数量均高于传统甘油组,且胶原纤维排列更为整齐规律,目前该技术已成功应用于临床。在人类同种异体移植研究中,植入的透镜无排斥反应且保持透明,术后70%的患者矫正远视力有所提高,营养胶囊保存为透镜及其他活体组织的保存与临床再利用带来了新的可能。

6 总结与展望

人角膜基质透镜的再利用为角膜疾病的治疗提供了新思路。研究表明,当条件允许时,可选择超低温冷冻联合介质保存法,其可降低透镜免疫原性并可长期保存。在设施不完善的情况下,介质保存(如DX液、甘油、硅胶等)仍是首选方法,去细胞化法及营养胶囊保存法目前未能广泛使用,但随着制备工艺的精进与简化,去细胞化法及营养胶囊保存法有望成为透镜保存的理想方法。目前,尚无可以完全满足临床需求的保存方法,因此需要更多的临床实验研究,探讨可长期保存且能维持角膜透镜特性及运输方便、技术简单且费用低廉,并适合中国现阶段角膜基质透镜库和医疗情况的保存方法。相信随着更全面、深入的研究和更多规范化角膜基质透镜库的运行, SMILE来源的角膜基质透镜将会得到更好的再利用,从而为角膜病患者带来光明与希望。