乌司他丁抑制TLR4/NF-κB信号通路对心肺复苏大鼠心功能的改善作用

陈建春 思永玉 李元 李福全 蒋俊

心脏骤停(cardiac arrests,CA)属于高发病率疾病[1],尽管心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)技术和复苏后护理在一定程度上提高了患者生存机会,但脑损伤导致患者在恢复自然循环后仍有很高的死亡和残疾率[2,3]。心肌功能障碍导致的低心排血量加重了器官功能障碍,并降低了心脏骤停幸存者的长期神经预后[4,5]。CA幸存者的后遗症,包括缺氧脑损伤、心肌功能障碍和全身性缺血/再灌注反应,这被描述为心脏骤停后综合征(PCA),在PCA的发展过程中,全身性缺血/再灌注反应可引发全身性炎症级联反应,这是其典型病理过程,并导致多器官功能障碍性疾病(MODS)的形成。这一过程类似于全身炎性反应综合征(SIRS),因为促炎因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)可被视为PCA的损伤生物标志物[6]。核转录因子NF-κB亚单位p65的激活导致炎性细胞增加其促炎因子的表达和合成[7, 8],在许多Toll样受体(TLR)信号通路中,TLR4的激活被认为是有害的,因为它对炎症信号通路有影响[9]。Gui等[10]证明,TLR4/NF-κB途径的下调减少了心肌梗死的大小并改善了心脏功能。在本研究中,我们旨在探究乌司他丁对心肺复苏大鼠的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 从查士利华医药技术(上海)有限公司[动物许可SYXK(沪)2022-0001]获得18只SPF级雄性Wistar大鼠,体重360～380 g,年龄12周。将动物圈养在恒温(23±1)℃环境中,光照/黑暗周期为12 h,自由进食和饮水。

1.2 血流动力学监测 大鼠(12周龄)通过腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)进行麻醉[21, 22]。用PE 200导管(angiocath,becton dickinson)对动物进行气管插管,并进行机械通气(Flexivent EC-VF-2,Scireq Scientific Respiratory Equipment Inc)。呼吸机设置:潮气量0.8 ml/100 g,呼吸频率90次/min, FiO2为1.0。通过右股动脉插入一个充满0.9%氯化钠溶液的PE-50管来测量动脉血压。为了测量左心室压力,通过右颈动脉插入另一根充满0.9%氯化钠溶液的PE-50管,并推进到左心室,进行超声心动图和左心室压力波形检测。液体和药物通过右颈静脉途径给药。基于PC数据采集系统(ADI Instruments, Inc.)记录血液动力学参数。每小时测量1次血流动力学参数,并在心脏骤停前至自主循环恢复(ROSC)后第4小时进行监测。使用Philips Sonos 5500彩色多普勒超声心动图(Philips, Andover, MA, USA)测定左心室(LV)射血分数(EF)。左心室收缩功能用左心室压力为40 mm Hg时的dp/dt(dp/dt40)来表示。用于检测血液温度的热导管通过左股动脉放置,并通过固定长度法推进到胸主动脉。用热稀释法测量心输出量,然后用Cardio-Max Ⅱ系统(Columbus Instrument, Columbus, OH, USA)进行分析。

1.3 窒息致心脏骤停动物模型及研究设计 通过关闭呼吸机和夹住气管内导管诱发窒息的心脏停搏。窒息后不久出现心动过缓和低血压,随后出现收缩期心律,血压无法测量。心脏骤停被定义为平均股动脉压力<10 mm Hg。在9.5 min的窒息引起的心脏骤停后,72 h的存活率为50%[23]。窒息9.5 min后,通过静脉注射肾上腺素(0.01 mg/100 g),并由同一研究人员对所有动物以200次/min的速度用食指进行胸部按压以实施心肺复苏。对胸外按压进行调整以提供监测中看到的统一速率,并在复苏过程中提供>20 mm Hg的目标主动脉舒张压。通常在3 min内达到ROSC,如果6 min内不能获得ROSC,则排除动物。这是一项随机的动物研究,以调查UTI治疗的效果(每组n=6,总n=18)。UTI治疗组在ROSC后以100 mg/kg UTI (tianpu biochemistry and medicine corporation, Sichuan, China)静脉注射[24]。对照组以等量的普通0.9%氯化钠溶液输注。在治疗期间,体温保持在36.5℃。

1.4 存活率 在有创监测4 h后,从所有动物身上拔出导管和气管插管。动物在拔管后1 h内接受了1 ml 0.9%氯化钠溶液的腹腔注射,并被送回笼子。每隔12 h对所有大鼠的健康状况进行仔细监测,记录生存状况,通过丧失自主呼吸运动和超过2 min无心跳来确认死亡。对不同组间的存活率进行比较。如果动物达到人道的终点标准,包括体重与基线相比低于20%或持续发作超过10 min,立即实施安乐死。所有的动物都在达到安乐死的标准之前死亡,因为在心脏骤停和复苏的实验中,动物通常会突然死亡。

1.5 动物分组 大鼠被随机分配为3组:(1)sham组(n=6);(2)control组(心肺复苏组,n=6);(3)UTI组(心肺复苏联合乌司他丁治疗组,n=6)。根据组别设计,每只大鼠的尾巴上都有不同颜色的标记,笼子上标有组别名称。sham组大鼠经历了除心脏骤停和心肺复苏以外的所有操作程序。UTI组进行心肺复苏,在恢复自发循环后,接受静脉注射乌司他丁,control组的大鼠分别相同体积的盐水。

1.6 神经系统缺损的评估

1.6.1 神经系统检查:由对实验设计保密的调查员进行的,使用的是神经系统缺损评分(neurological deficit score, NDS),其范围80(最佳)～0(脑死亡),包括一般行为缺损的子评分:意识正常、昏迷或无反应,睁眼唤醒和呼吸正常、异常(通气不足或过度)或没有呼吸。存活大鼠的NDS在心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)后24、48和72 h被评估。

1.6.2 脑干功能评估:①嗅觉:对食物气味的反应;②视觉:头部对光的运动;③瞳孔光反射;④角膜反射;⑤惊吓反射;⑥对胡须刺激的反应;⑦对液体或固体的吞咽。

1.6.3 运动评估的子分数:包括力量测试正常、异常(僵硬或无力)和没有运动。运动行为子得分是根据步态协调来评估的,分为正常、异常或无。如果大鼠能穿过离地面0.5 m高的2 cm宽和1 m长的横梁,则判断其在横梁上的平衡是正常的;如果大鼠尝试过但没有继续,或暂时停留而跌倒,则判断为异常。如果大鼠放在横梁上后立即掉下来,则评估结果为无。

1.6.4 感觉评估的子分数:包括对肢体挤压的反应为轻快的退出、弱或异常的反应(伸展或弯曲的姿势)和无反应。

1.6.5 其他评估的行为反射分值:①扶正反射(动物仰卧,并能纠正到直立位置);②转弯小巷(使动物在15 cm×0.5 m的小巷尽头行走并转回);③视觉放置(动物被抬起,并能在视觉上确定物体和深度);④负地轴(将动物仰卧在倾斜45°的平面上,动物能自我纠正并在斜面向上移动)。最后一个分项评估了癫痫发作(抽搐或非抽搐)的发生情况。

1.7 转棒疲劳实验 转棒疲劳实验评估大鼠的运动协调和平衡能力。它包括适应性训练和测试过程。在CA手术前,每组大鼠都要连续训练3 d。旋转棒疲劳计被设置为4 r/min。动物每天训练3次,每次至少15 min,2次训练的间隔时间至少15 min。最后的测试在ROSC后5 d进行。将所有存活的大鼠单独放在旋转杆上,在260 s内将旋转速度从4 r/min提高到40 r/min,并记录大鼠从开始到跌倒的时间。该实验重复3次,最后以摔倒前的平均时间作为结果。

1.8 血清炎性因子水平 ROSC 48 h后采集眶后血样(0.8～1.2 ml),通过12 000 g离心10 min分离血清,储存在-80℃直至分析。使用商用ELISA试剂盒(R&D system)分析IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

1.9 Western blotting ROSC后第5天,解剖双侧前额叶皮层,将左侧皮层组织匀浆用于Western blotting。使用裂解缓冲液(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)制备总蛋白裂解物,所述裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)和磷酸酯磷酸酶抑制剂混合物(Roche,Nutley,NJ,USA)。BCA分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)用于测量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离每个泳道包含20 μg总蛋白的样品,然后转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜约1 h,并在4℃下与下列初级抗体一起孵育过夜:兔多克隆抗TLR-4抗体(1∶1 000;Abcam,USA);兔多克隆抗p65抗体(1∶1 000,Abcam,USA);兔多克隆抗p-p65抗体(1∶1 000,Abcam,USA);GAPDH (1∶5 000; Abcam,USA)。在与第二抗体孵育后,使用增强化学发光试剂(Pierce,IL,USA)显现免疫反应条带,并使用GeneSnap软件7.08版可视化。使用Image J软件对蛋白量进行定量,并根据同一样品中GAPDH的密度进行标准化。

2 结果

2.1 乌司他丁治疗提高大鼠存活率,改善心脏骤停后的心功能 sham组的6只大鼠全部存活,control组和UTI组大鼠的存活率分别为50%和66.7%,但差异无统计学意义(P=0.2432)。诱导心脏骤停前(Pre-PR)和ROSC时的血流动力学参数在3组间无显著差异。与control组比较,UTI组在ROSC后1～4 h内的左心室射血分数上升。抢救后第1小时,UTI组心率较低,然而2组心率在抢救后的整个时期内无差异,以dp/dt40表示的左心室收缩功能在心脏骤停和复苏后2组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组左心室射血分数、心率和左心室收缩功能比较 n=6,

2.2 乌司他丁改善心肺复苏后大鼠神经认知功能、运动协调和平衡 在sham组,NDS评分在所有时间点都接近80分。CA后,对照组的神经功能缺损评分明显低于sham组,UTI治疗显著减轻了神经功能缺损评分。CA/CPR后,control组存活的大鼠平均速度,大鼠行走总时间,大鼠下落时转棒速度和总行走距离,而UTI的应用有效地减弱了CA/CPR带来的神经系统损伤及运动失调(P<0.01)。见表2、3。

表2 在ROSC后24、48和72小时评估的神经功能缺损评分 n=6,分,

表3 乌司他丁改善运动协调和平衡 n=6,

2.3 乌司他丁降低心脏骤停/心肺复苏后促炎因子的表达 与sham组比较,心肺复苏后2 h,血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。然而,复苏后应用乌司他丁减少了IL-1β、TNF-α、IL-6的产生,差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 3组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平比较 n=6,

2.4 乌司他丁抑制TLR4/NF-κB通路活性 Western blotting结果显示,与sham组比较,control组TLR4蛋白表达及p-p65/p65表达水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。而在施用乌司他丁后,TLR4蛋白及p-p65/p65表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5,图1。

图1 乌司他丁抑制TLR4/NF-κB通路活性

表5 Western blotting检测ROSC第5天后大鼠大脑皮层TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平 n=6,

3 讨论

CA/CPR诱导全身缺血再灌注(I/R)损伤,激活免疫系统,引起全身炎性反应。在CA/CPR过程中,白细胞、巨噬细胞和组织常驻免疫细胞识别损伤并释放主要细胞因子,进而诱导白细胞的募集和活化,放大炎性反应[25]。作为中枢神经系统(CNS)的重要常驻免疫细胞,小胶质细胞表达各种细胞因子受体,识别IL-1β和TNF-α等。因此,小胶质细胞在I/R损伤后会过度活化,释放过量的促炎细胞因子,损害神经功能[26]。炎症对于CA/CPR后神经功能缺损的发病机制至关重要[27, 28]。IL-6是另一种众所周知的细胞因子,它在脑缺血后被上调,IL-6的血清水平与脑梗死体积相关,并且是早期神经恶化的有力预测因子[29]。

乌司他丁(ulinastatin)于20世纪80年代首次在人类血液、尿液和其他组织中发现[10],对多种蛋白酶有抑制作用[11],已经显示出对大脑缺血-再灌注损伤的器官保护作用[12]。乌司他丁通过抑制JNK/NF-kappaB信号通路和PI3K/Akt/Nrf2通路来减轻炎症和抵抗氧化应激[13,14]。此外,乌司他丁可以通过激活Nrf-2/HO-1信号通路,对缓解脑缺血再灌注损伤提供一定程度的保护,并可能通过内质网应激诱导的细胞凋亡通路改善心肌缺血再灌注损伤[15,16]。此外,作为一种天然的抗炎分子,乌司他丁在内镜逆行胰腺造影术后胰腺炎的药物预防和严重减压病的治疗,甚至在SARS-CoV-2感染的治疗中都有很好的前景[17-19]。在亚洲地区,UTI被用作治疗急性炎症性疾病的基本药物,包括胰腺炎、败血症和休克[20]。

一些研究者分析了乌司他丁在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用机制,Kawamura等[30]报道,UTI通过抑制IL-8和IL-6的释放,在与体外循环心内直视手术相关的MIRI中发挥心脏保护作用。Yang等[30]提出,乌司他丁可以通过下调TNF-α的表达和抑制由c-Jun N-末端激酶(JNK)和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导的MIRI来保护心脏功能。本研究发现心肺复苏组ROSC后血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高,而乌司他丁治疗减弱了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的升高,改善了神经功能预后。并且,转棒疲劳实验显示乌司他丁有效改善心脏骤停/心肺复苏后大鼠神经认知功能、运动协调和平衡。TLR4作为一种模式识别受体,参与I/R损伤诱导的炎性反应[31],TLR4缺陷型小鼠在心肌I/R损伤后经历了心肌梗死面积的减小,这是由炎性信号通路活性的降低介导的,如多形核嗜中性粒细胞的积聚和氧化应激的激活[32]。NF-κB是一个重要的促炎症转录因子[33],TLR4的激活与促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达以及几种细胞类型中NF-κB信号途径的激活有关[34, 35]。在本研究中,与sham组相比,control组TLR4/NF-κB信号通路活性被激活,而在施用乌司他丁治疗后,大鼠大脑皮层TLR4、p-p65/p65水平显著下降,表明TLR4/NF-κB通路活性被抑制。

我们的研究有一些局限性。首先,这项研究是在没有任何与心脏骤停相关的潜在疾病的动物中进行的;第二,可处理的实验动物数量有限。在未来的研究中,我们将在更大样本量的动物中对该机制进行验证。