GnRHa黄体支持在IVF/ICSI-ET中的应用

王飞 曾湘晖

正常的黄体功能是妊娠成功的保证。控制性超促排卵(COH)作为辅助生殖技术(ART)的关键环节,通过药物刺激多个卵泡同时发育并成熟,从而获得多个卵和较高质量胚胎, 增加受孕率。育龄期女性在自然月经周期中,黄体功能不全(luteal phase defect,LPD)发生率为3%～10%,但在COH中,LPD则几乎为100%[1]。通常因为在卵巢排卵后,出现黄体早退的现象,根本无法分泌够剂量的孕激素,内膜分泌反应性因此出现延迟,未达到与胚胎发育彻底的同步,影响妊娠结局。迄今为止,临床上对于行黄体支持药物种类、剂量、剂型以及使用方案未达成统一共识。常用的黄体支持的药物主要人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)、P、雌激素(estradiol,E)。黄体酮直接使用或与HCG和E联合使用是最常用的方案。使用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRHa)行黄体支持治疗,以期有效改善妊娠结局,其有效性和安全性正处于不断探究过程中。国外有研究表明,GnRHa有类似避孕药作用,可引发黄体溶解,不利于胚胎种植[2]。Balasch等[3]发现黄体中期添加GnRHa,妊娠率不仅没有降低,反而胚胎着床率较前升高,猜测GnRHa可能通过刺激促黄体生成素(basal luteinizing hormone,LH)的作用,改善妊娠结局。2015年国内专家共识中首次提到,GnRHa作为新增黄体支持的药物备选药物之一,肯定了其疗效,该药物可通过增强黄体功能,明显提升了胚胎植入成功率,从而改善妊娠结果[4]。一项研究发现黄体期添加GnRHa增加出生率、多胎率,有助于妊娠,且拮抗剂方案中效果更优[5]。近年来,GnRHa也被用于黄体支持,但因机制尚不明确,仍存在争议。因此本课题拟探讨在拮抗剂新鲜胚胎移植黄体期,于常规黄体支持(黄体酮+芬吗通)基础上添加不同剂量GnRHa对ART妊娠结局的影响,为有效标准提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年1月至2023年2月于我院生殖中心行体外受精(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF)/卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)拮抗剂方案鲜胚移植314例患者临床资料。该研究项目已于2021年10月通过人类遗传资源与医学伦理审查(2021SQCJ4499)与我院医学伦理审查(2021-64),患者签署了知情同意书。采用前瞻性对照临床试验,研究在拮抗剂新鲜胚胎移植黄体期于常规黄体支持(黄体酮+芬吗通)基础上再行添加不同剂量GnRHa,对ART妊娠结局的影响,按剂量依次分为A组:未添加GnRHa 95例;B组:添加0.1 mg GnRHa 92例;C组:添加0.3 mg GnRHa 55例;D组:添加0.4 mg GnRHa 72例。4组患者男女年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、AMH、 AFC、FSH、LH、E2差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组患者一般情况比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①年龄20～40岁;②基础促卵泡激素(FSH)<10 U/mL;③抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)≥1.2 μg/L;④体重指数(Body mass index,BMI)正常;⑤移植周期数≤2,鲜胚移植胚胎为卵裂期胚胎(D3),且至少一个优质,且移胚总数≤3个;⑥拮抗剂方案,进行控制性超促排卵。

1.2.2 排除标准:①子宫器质性疾病(子宫肌瘤、子宫畸形、内膜息肉、内异症、宫腔粘连等);②新鲜胚胎移植周期HCG日,患者血清孕酮值≥1.52 ng/ml;移植日B超示子宫内膜厚度<7 mm;③输卵管中重度积水、输卵管倒流、卵巢过度刺激综合征(OHSS);④内分泌及代谢性疾病(如多囊卵巢刺激症(PCOS)、甲亢、甲减、高泌乳素血症等);⑤IVF/ICSI-ET禁忌证;⑥未签署知情同意书的患者。

1.3 COH方案 使用拮抗剂方案,月经第2～3天测血FSH、LH、E2、P,依据性激素水平、窦卵泡数(basal antral follicle count,AFC)及大小决定是否开始启动FSH,根据患者的卵巢功能(AFC和AMH)、年龄、BMI决定启动剂量。当主导卵泡直径达到12～14 mm时,根据LH值,决定是否使用GnRH-ant(思则凯,默克雪兰诺,法国)0.25 mg/d,规律监测B超和血清E2、LH、P的激素水平变化情况。当双侧卵泡直径>17 mm的数量>3 h,再根据患者血清中各性激素水平,选择艾泽250 μg板机或双扳机:注射用人绒毛促性腺激素(HCG,安徽丰原药业)2 000 U+注射用醋酸曲普瑞林(达必佳,德国辉凌)0.2 mg。扳机后36 h B超检查开始取卵,并在取卵的当天启动黄体支持。取卵日取精,行IVF或ICSI常规体外受精,移植第3天卵裂期胚胎数目≥1个,至少有一个优质胚胎,对符合条件的剩余卵裂胚进行囊胚培养,并行囊胚冷冻保存。

1.4 鲜胚常规黄体支持方案 自取卵日开始,通过肌内注射提供黄体酮40 mg*1次,此后黄体酮60 mg(黄体酮软胶囊600 mg/d,阴道放置,移植日给予芬吗通(黄片2 mg/d,Abbott Biologicals B.V.),直至移植后14 d,妊娠者维持至移植后8～10周。

1.5 添加GnRHa的黄体支持方案 A组:常规黄体支持;B组:添加0.1 mg GnRHa,在常规黄体(地屈孕酮+芬吗通)支持基础上,取卵后第6天(移植后3 d)皮下注射0.1 mg GnRHa(醋酸曲普瑞林,0.1 mg/支,达必佳,德国辉凌);C组:添加0.3 mg GnRHa:(在常规黄体支持基础上,分别于取卵第2、5、8天单次皮下注射0.1 mg GnRHa);D组:添加0.4 mg GnRHa,(在常规黄体支持基础上,分别于取卵第2、4天单次皮下注射0.2 mg GnRHa)。移植后14 d测定血β-HCG,妊娠者维持至移植后8～10周。

1.6 胚胎移植 鲜胚取卵后72 h进行移植,移植胚胎为卵裂期胚胎(D3),至少一个优质,移胚总数≤3个。

1.7 观察指标及随访 主要指标:种植率、临床妊娠率、多胎率、早期流产率;次要指标:男女双方年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2、HCG日LH、E2、P水平及内膜厚度、获卵数、MⅡ卵数、总受精数、卵裂数、2PN数、优质胚胎率、优质D3胚胎数、可利用D3胚胎数、囊胚形成数、优质囊胚数、移植日内膜厚度、平均移植胚胎数等。随访:于移植后14 d对血液中的β-HCG进行检测,35 d B超可见孕囊和胎心跳动提示为临床妊娠。

2 结果

2.1 4组促排卵情况 4组为IVF受精方式,HCG日LH、E2、P水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 4组实验室数据及胚胎发育情况比较 4组患者在获卵数、MⅡ数、总受精数、卵裂数、2PN数、优质D3胚胎数、可利用D3胚胎数、囊胚形成数、优质囊胚数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组患者实验室数据及胚胎发育情况比较

2.3 4组患者妊娠结局情况比较 4组患者在胚胎种植率、早期流产率、多胎率等方面差异均无统计学意义(P>0.05),A组妊娠率低于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.4 与临床妊娠结局有关的单因素分析 根据患者是否发生临床妊娠,分为临床妊娠组与非临床妊娠组。2组在男女双方年龄、不孕年限、不孕类型、 BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2、HCG日LH、E2、P水平及内膜厚度水平方面差异均无统计学意义(P>0.05)。2组在获卵数、MⅡ卵数、总受精数、卵裂 数、2PN数、优质D3胚胎数、可利用D3胚胎数、囊胚形成数、优质囊胚数、移植日内膜厚度等方面差异无统计学意义(P>0.05)。临床妊娠组的平均移植胚胎数、GnRHa黄体支持占比均高于非临床妊娠组(P<0.05)。见表5。

表5 临床妊娠结局相关指标单因素分析

2.5 与临床妊娠结局有关因素的Logistic回归分析 将P值≤0.05的变量纳入回归分析模型。Logistic回归分析结果发现:平均移植胚胎数对临床妊娠结局影响具有统计学意义(P<0.05);GnRHa黄体支持占比对临床妊娠结局影响具有统计学意义(P<0.01)。排除混杂因素后发现添加GnRHa、移植胚胎数均是影响拮抗剂方案鲜胚移植患者临床妊娠结局的关键因素。见表6。

表6 临床妊娠结局相关指标Logistic回归分析

3 讨论

3.1 GnRHa的结构及发挥黄体功能的机制 GnRHa是GnRH第6、10位的氨基酸替换形成的新型结构更稳定且半衰期更长的十肽化合物,同时其与GnRH受体亲和力增加100～200倍。GnRH通过垂体门脉系统,作用于垂体前叶产生FSH和LH,而GnRHa通过持续性分泌,消耗了大量的GnRH受体,导致垂体脱敏,抑制了LH的产生,对黄体功能造成影响,同时也影响了子宫内膜的容受性。

GnRHa对于黄体支持的有效性和安全性的作用原理尚不清楚,可能与其多种不同作用机制有关。在现阶段认为GnRHa用于黄体支持的可能机制为以下几个方面:(1)GnRHa刺激垂,E、P分泌增多,接近于自然周期,更有利于妊娠的发生和维持。另外,GnRHa可能通过对黄体施加直接作用来产生雌孕激素。(2)研究发现人类胚胎、胎盘滋养层细胞及子宫内膜都有GnRHa受体mRNA,黄体期给药GnRHa能加速已种植的胚胎产生HCG,有益于早期胎儿发育[6]。(3)释放LH可以促进子宫内膜细胞血管生长因子,以及与胚胎种植有关的细胞因子的表达,从而有利于胚胎的着床和发育[7]。(4)GnRHa可明显减低NK细胞的毒性,提高免疫功能,具有更有利于胚胎移植环境[8]。

3.2 添加GnRHa黄体支持在拮抗剂方案鲜胚移植周期中的作用 本研究中使用拮抗剂方案行鲜胚移植患者,在常规黄体支持方案中添加不同剂量(0.1 mg、0.3 mg、0.4 mg)GnRHa组的临床妊娠率(61.96%,63.63%,62.50%)均明显高于未添加GnRHa组(44.21%)。而添加不同剂量(0.1 mg、0.3 mg、0.4 mg)GnRHa种植率(39.77%,40.00%,36.59%)、早期流产率(14.04%,11.76%,11.11%),相较于未添加GnRHa组种植率(33.89%)、早期流产率(14.29%),虽无统计学差异,但种植率均有一定程度升高,早期流产率有下降的趋势。

本研究结果提示,在拮抗剂方案鲜胚移植周期中,常规黄体支持(地屈孕酮+芬吗通)的基础上,加用GnRHa能明显提高临床妊娠率,改善妊娠结局,但添加3种不同剂量GnRHa的患者妊娠结局也略有差别。综合本研究对使用不同剂量GnRHa的妊娠结局考虑,分别于取卵第2 d、5 d、8天单次皮下注射0.1 mg GnRHa,总剂量达0.3 mg时,种植率和临床妊娠率在3组中效果最佳,这与曲丹妮等[9]研究结果相似,持续间断给予GnRHa可改善ART妊娠结局。其可能原因为GnRHa虽抑制内源性的LH峰,但半衰期短,作用时间不长,仅可持续24～36 h,且取卵后6 d为体内黄体的最低期,加用GnRHa可再次刺激垂体LH的分泌,及时挽救了内源性黄体,安全并有效地发挥了黄体支持的作 用,对妊娠结局起到了积极的作用。

Oliveira等[10]发现拮抗剂方案加用GnRHa后,临床结局的各项指标(种植率和临床妊娠率)均有大幅度的升高。国内近期也有研究显示,行IVF/ICSI患者,加用1次0.1 mg GnRHa(曲普瑞林)也显著改善了妊娠结局[11],且有大样本数据结果显示,在低反应人群(FSH<8 mU/mL)中添加0.1 mg GnRHa,也达到了相同的效果[12]。一项纳入行拮抗剂方案鲜胚移植的328周期ICSI患者的研究提示,于相同时机添加相同剂量GnRHa,提示添加GnRHa并未提高胚胎种植率、临床妊娠率[13],与本研究结论不一致。分析其可能原因:虽抑制效应能快速消去,但黄体中期仅仅只是注射0.1 mg GnRHa刺激黄体,剂量太小,产生的孕酮未达到能发挥黄体支持的生理剂量的阈值,发挥效果显微。有国外Meta分析显示多剂量的GnRHa使用的活产率较单剂量高[14]。因此国内外学者研究多剂量的GnRHa黄体支持对妊娠结局的影响。

Qublan等[15]研究显示移植着床率、临床妊娠率、活产率也显著升高。Aboulghar 等[16]发现不会提升继续妊娠和临床妊娠的机率,妊娠结局无影响。国外有RCT显示选择ICSI患者,分别移植日后3 d皮下注射1次1 mg GnRHa(亮丙瑞林100例),与移植日后第3、6天各注射1次(100例)比较,发现添加1次与2次妊娠结局无差异,且与未添加组相较,多胎率明显升高[17]。因此可推测认为单次与多次添加GnRHa无差异,反而增加多胎率。各项研究的得出结论不一,但其研究报道少,周期数少,缺乏强有力临床实验数据反复验证,因而对GnRHa用于黄体支持用法剂量存在争议。

3.3 拮抗剂鲜胚移植周期中添加GnRHa的安全性 GnRHa的黄体支持作用可能有利于妊娠发生,但胚胎移植以后使GnRHa是否对母儿有不良影响,增加胎儿畸形的发生。理论上GnRHa半衰期较短,当皮下注射0.1 mg GnRHa后,其生物有效性大约持续24 h,可及时排泄。用药后发生妊娠,此时的胚胎则不受GnRHa影响。

近年国外有研究指出,拮抗剂方案中添加GnRHa增加多胎妊娠的发生率[18]。国内余璐萍等[5]亦得到了相同的结果,添加GnRHa组的多胎率高于未添加组。李洁等[19]研究显示,在移植后0、2 d分别添加GnRHa各0.1 mg,结果提示2组的自然流产率无差异,且出生的婴儿中无畸形儿,表明GnRHa应用于拮抗剂方案的黄体期是相对安全的。国内前瞻性研究在黄体支持基础上持续间断皮下注射GnRHa,发现添加多剂量GnRHa长期随访安全性良好[9]。

国外前瞻性对照研究中显示,于赠卵周期ICSI后的第6天注射单剂量的0.1 mg GnRHa,并未增加流产率[8],这与本研究的结论相一致。另有研究纳入120例子宫内膜厚度不超过7 mm的患者,在GnRHa添加组中,内膜增厚的速度比常规黄体支持组更快,同样胚胎种植率和临床妊娠率亦有明显提升[15]。在卵巢低反应(FSH<8 mU/mL)患者中也得出相同的结论[12]。还有学者发现,对第1次IVF失败者,根据标准黄体支持方案取卵开始,连续14 d每日持续0.1 mg GnRHa注射,比OPU后6 d注射1次GnRHa更有效,多剂量组能取得较好的妊娠结局,可显著提高妊娠率和活产率,提高妊娠率及活产率,且安全持久[20]。

既往研究发现,黄体期给药GnRHa提示还未见能直接引起神经系统,消化系统和泌尿系统的损伤,进而导致胎儿畸形的发生,但并不排除不影响早期胚胎发育的可能性[8, 21]。国外研究表示,黄体期加入GnRHa,具有重要临床价值[22],今后需进一步跟踪调查其围产期结局、胎儿神经系统、先天畸形等问题安全性。

目前大多数研究显示鲜胚移植黄体中期添加GnRHa有利于临床妊娠结局,且合适并安全的多剂量间断给药在胚胎着床率及临床妊娠率方面效果较优,但添加时机及剂量尚无明确规定,且GnRHa用量超出安全范围会导致垂体功能受到抑制,GnRHa黄体支持作用不仅无法发挥,反而带来弊端[23-25]。目前国内进行的相关研究方法,多为取卵后第6天添加0.1 mg GnRHa。临床上多根据经验用药,此时医生更应熟练掌握药物适应证及禁忌证,给ART助孕患者获得良好结局打下基础。

综上所述,在黄体期加入GnRHa的拮抗剂方案中,可以改善此方案新鲜移植周期的妊娠结果。采用GnRHa扳机联合黄体期应用,以增强黄体支持作用,降低OHSS的发生机率也是可行的。内膜较薄、反复IVF/ICSI-ET失败的患者,赠卵周期等均可将于黄体期添加GnRHa作为黄体支持新型选择。考虑到拮抗剂鲜胚添加GnRHa可能增加多胎率的风险及添加多剂量的效果更优,因此可相对减少移植胚胎的数量,增加GnRHa的剂量,从而降低多胎率,改善妊娠结局。