高寒草地优势植物根际细菌促生特性及初步鉴定

雷 杨，白 洁，李智燕，姚 拓

（1.甘肃农业大学草业学院 / 草业生态系统教育部重点实验室 / 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070；2.甘肃省草原技术推广总站, 甘肃 兰州 730070）

作为全球主要的陆地生态系统之一的高寒草地生态系统，在水土保持、涵养水源、生态平衡等方面发挥着重要的作用[1]。近年来，由于高寒草地独特的生境与人类活动，破坏了高寒草地生态平衡，使植被群落结构和土壤的稳定性降低，高寒草地面临着严重退化的威胁。随着高寒草地的退化，生长于高寒草地的优势植株从多年生禾本科逐步向一年生草本植物发生逆向演替，这为其他杂类草提供了更多的生长机会与空间[2-3]，不仅会影响土壤微生物群落结构的改变[4]，还可能引起病原微生物的增加从而导致植物土传病害的发生[5]，加剧高寒草地的退化。根据仁青吉等[6]研究报道，短期内在甘南高寒退化草地施用化肥，草地修复效果明显提高。但化肥施用在调控修复退化高寒草地的生物多样性上并不具有可持续性效果[7]，而林丽等[8]、任卓然等[9]和Zhao 等[10]研究发现在退化高寒草地施用微生物肥料能够促进植被生长，土壤养分和植物根际微生物群落也相应得到了改善，并且研究表明微生物肥料作为传统肥料的替代品能够实现可持续农业[11]，表明修复退化高寒草地来维持生态平衡还需要着眼于微生物的调控[12]。

植物根际促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是一类通过固氮、溶磷、分泌植物生长激素特性和拮抗病原微生物以促进植物生长的有益根际细菌[13-14]。研究表明PGPR 作为生物肥料在植被修复方面可促进植物生长，并增强植物抗逆性[15]。钟松等[16]在黄河源区高寒草地施用不同PGPR 菌肥，发现其均能提高土壤速效养分，意味着PGPR 可在探索退化高寒草地的修复技术和可持续生态修复措施中发挥出至关重要的作用。市面上普通的PGPR 菌剂在修复高寒退化草地上面临很大挑战。研究表明在高寒地区低温等恶劣的生存环境，来自高寒地区生长植物根际分离的PGPR 会发挥更好的作用[17]。因此，筛选出兼具多种优良特性的耐低温PGPR 对高寒退化草地生态恢复具有很好的应用前景。因而，众多研究学者对高寒草地PGPR 的研究关注越来越多，且有研究发现具有耐低温特性的PGPR 在高寒退化草地中具有发挥修复功能的潜力[18-19]。目前，在我国适用于修复退化高寒草地微生物肥料的研发以及优良耐低温PGPR 菌株资源的筛选少见报道，鉴于高寒草地的独特生境，筛选来自于该独特生境的植物根际有益细菌，通过评价其促生特性，进而筛选获得耐低温且具有优良特性的菌株，后期可用于增强土壤与植物的有益互作，有利于推动与维持高寒草地生态系统的稳定和良性循环。

本研究从前期研究获得的高寒草地功能微生物资源库中，选取18 株菌株，在低温条件下，测定其固氮、溶磷、分泌植物生长激素(indole acetic acid,IAA)和生防能力，从中筛选出综合特性较优的PGPR 菌株，并结合分子生物学方法将目的菌株进行鉴定，为后期开发可应用于高寒退化植被修复的微生物菌剂提供优良耐低温菌株资源，为高寒草地生态恢复提供科学支撑和理论依据。

1 材料方法

1.1 试验材料

1)供试培养基： LB (luria bertani, LB) 固体培养基[20]用于菌种的保藏与培养； NFM (nitrogen free medium)培养基用于固氮酶活性的测定[13]；NBRIP(national botanical research institute’s phosphate，NBRIP)培养基[20]用于溶无机磷特性测定，NBRIP 培养基中的相同质量的植酸钙来代替磷酸钙用于溶有机磷特性测定[18]；King 氏液体培养基用于IAA 的测定[20]；PDA 培养基用于真菌培养[21]。

2)供试菌株和病原菌：前期在15 ℃条件下分离获得的18 株候选菌株(表1)。

表1 供试菌株Table 1 Strains tested

病原菌为前期分离所得病原菌：茄病镰刀菌(Fusarium solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliformi)、锐顶镰孢菌(Gibberella acuminata)[22]。

1.2 试验方法

1.2.1 固氮酶活性测定

用接种环将菌株挑取一环接种于盛有10 mL 半固体NFM 培养基中(血清瓶，规格30 mL)，每株菌3 次重复，对照为不接菌处理，用棉花塞封口后在培养箱中培养48 h (15 ℃)后采用乙炔还原法[23]测定菌株固氮酶活性。

1.2.2 溶磷特性及pH 测定

将供试菌株接种至盛有已灭菌的50 mL NBRIP(有机磷培养基用相同质量植酸钙代替NBRIP 培养基中的磷酸钙)液体培养基[24]的150 mL 三角瓶中，菌株接种好以后培养12 d (15 ℃、180 r·min-1)，钼蓝比色法[24](molybdenum blues colorimetry, MBC)测定菌株溶磷量，用酸度计测定每株菌培养液的pH。

1.2.3 菌株分泌IAA 特性的测定

分别接种500 μL 菌悬液(108cfu·mL-1)于已灭菌装有50 mL 液体king 培养基的150 mL 三角瓶中。置于15 ℃、180 r·min-1摇床培养12 d，后吸取以上各菌株培养液 10 mL 离心10 min (10 000 r·min-1、4 ℃)，吸取上清液5 mL，并加等体积的Salkowski 比色液[25]，测定培养液在波长530 nm 的吸光度值，通过标准曲线计算所测IAA 浓度(μg·mL-1)[24]。

1.2.4 菌株生防能力的测定

利用平板对峙法[13]初步测试所有菌株对上述4 种病原菌的拮抗作用。使用直径为90 mm 的培养皿。采用“十”字交叉法分别在中心处点接病原菌菌丝，在“十”字两端距中心23 mm 处点接供试菌株，重复3 次，对照平板为单接病原菌丝。25 ℃培养5～7 d，待整个平板被对照铺满时，计算拮抗菌株抑制率，按照以下公式计算：

通过初筛发现接有供试菌株的PDA 平板有抑菌带之后，按照上述方法复筛，3 次重复，观察测定拮抗菌株抑菌带宽度。

1.2.5 优良耐低温PGPR 菌株鉴定

将上述筛选的溶磷菌株LPA7、LNA2，固氮菌株CND1，分泌IAA 菌株LMJ2，生防菌株LMG2、LMY8，平板划线接种于LB 固体培养基，培养48 h(15 ℃)。按照试剂盒说明书提取细菌总DNA 并进行PCR 扩增，后用1%凝胶琼脂糖电泳进行PCR 产物检测。利用正向引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和反向引物1 492R (5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′)扩增菌株的16S rRNA基因序列。25 μL 反应体系：2 × Taq PCR Master-Mix 12.5 μL、DNA 模 板 3 μL、正 反 向 引 物 各1.5 μL、ddH2O 6.5 μL。PCR 扩增参数设置：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，重复循环30 次；72 ℃总延伸10 min；将PCR 产物进行1%凝胶琼脂糖电泳检测后由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。测序结果在 EZBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)中进行序列比对分析。

1.2.6 数据统计与分析

利用Excel 2016 和SPSS 24.0 对数据进行数据整理、One-Way ANOVA 统计分析和Duncan 极差法进行差异显著性比较，图表数据为平均值 ± 标准误差；采用Origin 2021 软件绘图。通过MEGA7.0 软件以邻接法构建所测菌株的系统发育树，bootstrap 为1 000 次。

2 结果分析

2.1 18 株菌株促生特性

供试18 株菌株中除菌株CPB3、CPJ2、ZWA1、LMJ2未检测出固氮酶活性外，其余14 株菌在15 ℃培养下 的 固 氮 酶 活 性 介 于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1(图1)，其中，菌株ZWC1 的固氮酶活性最高，达230.52 nmol·(h·mL)-1，其次是菌株LMB5，为 216.49 nmol·(h·mL)-1，菌 株LTZ1 和CND1、ZWE1 的 固 氮酶活性分别为181.72、144.67、138.95 nmol·(h·mL)-1，菌株ZWF1 和LPA7 的固氮酶活性分别为95.46 和93.84 nmol·(h·mL)-1，其 余 菌 株 固 氮 酶 活 性 均 低 于69.46 nmol·(h·mL)-1。

图1 菌株的固氮能力Figure 1 Nitrogen-fixing capacity of strains

供试18 株菌株均能分泌生长激素IAA，分泌量介于12.45～71.71 μg·mL-1(图2)，其中以菌株LTZ1分 泌IAA 量 最 大，为71.71 μg·mL-1，其 次 是 菌 株LMJ2，分泌IAA 量为69.13 μg·mL-1。菌株LNA2 分泌IAA 量最小，为12.45 μg·mL-1。

图2 菌株分泌植物生长激素(IAA)的能力Figure 2 Indole acetic acid (IAA) secreted by strains

供试18 株菌株有机磷溶磷量介于51.76～115.06 μg·mL-1(图3)，18 株 菌 株 溶 有 机 磷 的pH 介于2.20～4.37，其中， 菌株ZWF1 的溶有机磷含量最高为115.06 μg·mL-1，pH 2.20。供试18 株菌株无机磷 的 溶 磷 量 介 于9.22～380.28 μg·mL-1(图4)，pH 4.07～6.64。其中菌株LNA2 溶无机磷量最高，达380.28 μg·mL-1，pH 4.29。其次菌株LPA7 溶无机磷量为321.57 μg·mL-1，pH 4.07。综上，供试18 株菌株均能溶无机磷和有机磷。

图3 菌株的溶有机磷能力Figure 3 Organic phosphate solubility of strains

图4 菌株的溶无机磷能力Figure 4 Inorganic phosphate solubility of strains

2.2 抑制植物病原真菌能力

通过测定18 株菌株对病原真菌茄病镰刀菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、锐顶镰孢菌的抑菌能力(表2)，初筛发现菌株LNA2、LMY8、ZWA1、LMJ2、LMG2 对病原真菌锐顶镰孢菌有抑制能力，而对其他病原真菌并无抑制能力。复筛发现菌株LMG2、LMJ2 对病原真菌锐顶镰孢菌的抑菌能力显著(P＜0.05)，抑菌率分别为31.00%和30.75%。

表2 植物根际促生菌(PGPR)对病原真菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) on pathogenic bacteria

2.3 优良耐低温PGPR 菌株鉴定

综合评价各菌株促生特性和抑菌效果，筛选出6 株优良PGPR 菌株，对其进行基于16S rRNA 基因序列的鉴定，通过同源序列比对分析，并构建系统发育树。其中，筛选得到的编号LMG2 菌株和LMJ2 菌株的16S rRNA 基因序列与Pseudomonas pisciumP50T的相似度分别为99.27%和99.51%； 另外两株编号为LNA2 和LPA7 的菌株与Pseudomonas neuropathica的亲缘关系最近，它们的16S rRNA 基因序列与P.neuropathicaP155T的相似度为99.11%。编号CND1的16S rRNA 基因序列与猴假单胞菌Pseudomonas simiaeOliT的相似度为99.78%，编号LMY8 的16S rRNA 基因序列与Pseudomonas kairouanensisKC12T的相似度为99.57% (图5)。

图5 基于16S rRNA 基因序列的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA showing the phylogenetic relationships among isolated strains

3 讨论

高寒草地的退化使得优势植被发生逆向演替，限制了植被根际的有益微生物发挥作用[26]。微生物肥料的出现，成为调控退化高寒地区植物、土壤及微生物三者的桥梁，使绿色高效的生态恢复方式成为了可能。因此，挖掘生存于高寒地区的多功能PGPR 菌株并研发微生物肥料，有望解决高寒退化草地修复的问题[27]。

氮和磷在植物生产、光合作用和大分子生物合成等过程中起着至关重要的作用。同时，在高寒生态系统中氮素和磷素是有机体必需的两种限制性营养元素；在生物固氮过程中，土壤微生物扮演着不可替代的角色[28]，合理发挥固氮菌的生物固氮作用，对于修复和维稳退化高寒草地生态有着重要意义。低温是高寒地区影响植物正常生长的因素之一，低温会导致植物细胞内产生大量氧自由基，从而降低抗氧化酶活性，最终导致植物细胞死亡，耐低温PGPR 的接种可以增强植物耐低温胁迫[17]。本研究测定的18 株耐低温菌株中除4 株菌低温下未表现出固氮酶活性外，除个别固氮能力较弱，剩余菌 株固氮酶活性介于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1。李明源等[19]在祁连山高寒草地分离的固氮菌株固氮能力与本研究相比较弱，但对垂穗披碱草(Elymus nutans)的生长有明显促进作用，也可推测本研究分离的固氮菌也具有促进植物生长的潜力。本研究所筛选得到的P.simiae菌株促生特性与白洁等[20]的研究结果相比，本研究在低温条件下测定的P.simiae固氮能力高于常温下测定的P.simiae固氮能力，可见即使菌株同源，但在不同温度的作用下固氮酶活性的大小仍有所不同，这与所分离PGPR 的植物、土壤、生境和地域等有关[13,23]。也可推测本研究筛选的固氮菌有望在实际使用中更适应低温的高寒草地，并发挥更好的固氮作用。溶磷菌能够通过分泌有机酸等物质来分解土壤中的难溶性磷酸盐，改善土壤结构与提高土壤养分促进植物吸收磷素，加速植物生长[28]。通过溶磷能力的测定，本研究中18 株菌株的溶有机磷量高于刘晓婷和姚拓[18]在红原高寒草甸植株根际筛选的溶磷菌溶有机磷量，溶无机磷量则反之，这也许与配制溶磷培养基时所选择的磷源、菌株自身特性有关[18]。本研究中菌株溶有机磷菌株的发酵液pH 整体偏低并与溶有机磷量没有关联，但溶无机磷量随发酵液pH 的降低而增大。杨美英等[29]研究发现，溶磷培养基中pH 越低，表示菌株在溶磷过程中分泌的有机酸含量越高，种类越多。后续可以针对本研究筛选的溶磷菌株进行有机酸种类的研究和分析，深入探究溶磷的机制和机理。

IAA 在植物的生长发育中必不可少。由根际微生物分泌的IAA 可促进植物地上部分的生长以及根系伸长，增加了参与养分吸收的根毛和侧根的数量[30]。Noori 和Saud[31]分离的20 株PGPR 中，有75%的菌株可分泌IAA，可分泌IAA 的PGPR 能够促进植物根系生长。本研究综合筛选获得的6 株假单胞菌株均能分泌IAA，表明6 株菌对高寒草地优势植株生长发育具有促生潜力。高寒草地的退化引起根际病原微生物泛滥易使植物病害发生，影响植物生长[5,32]。为此，在筛选优良PGPR 时，除了关注其固氮、溶磷和分泌IAA 能力，还需聚焦菌株在极端生境中是否具有抑制病原菌的能力。兰晓君[33]从天祝草原草(Koeleria macrantha)根际分离的生防芽孢杆菌TZF1 均对小麦长蠕孢(Helmintho sporium tritici-vulgaris)、茄链格孢(Alternaria solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等6 株病原真菌的抑菌率均在64%以上。杨成德等[34]从东祁连山高寒草地上珠芽蓼(Bistorta vivipara)分离的Z19 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对核盘菌属、丝核菌属等的植物病原真菌具有抗性，且可能具有应用在高寒草地的潜能。目前，芽孢杆菌属有关抑制病原菌的研究已非常成熟。而假单胞菌属菌株在植物病害的防治中也发挥着作用，前人研究发现，假单胞菌属菌株一般可通过产生如抗生素、植物激素、挥发性化合物氰化氢和铁载体等次级代谢物来有效控制植物病虫害的发生，有利植物的生长发育[35-36]，除上述假单胞菌属菌株通过产生次级代谢物来控制病害的途径，Chen 等[37]研究发现P.pisciumZJU60 可以通过调控真菌组蛋白修饰来抑制禾谷镰刀菌(F.graminearum)。有研究[22]报道，锐顶镰孢菌(G.acuminata)是引起植物土传病害的病原真菌之一，对植物的致病力仅次于禾谷镰刀菌，当前对该病原真菌的拮抗研究缺乏报道。在本研究中，通过平板对峙法研究得出有5 株菌株均对病原真菌G.acuminata表现出拮抗作用。其中拮抗作用最强的菌株LMG2 经鉴定为P.piscium，此菌株拮抗病原真菌的机制是否与上述蛋白调控有关还尚未可知，后续还需对该菌株拮抗病原真菌G.acuminata的机理进行深入研究。

本研究对候选菌株进行16S rRNA 基因序列比对后，分析结果显示均属于假单胞菌属，这可能与假单胞菌能在4～37 ℃条件下生长[38]，且具有分布广、耐受能力强的特性以及研究地区宿主植物所处生态环境的特殊性有关。并且从鉴定结果可知，存在两个菌株为同一个属同一个种且与模式菌株相似度相近，但由于菌株遗传特性不同，所表现的促生特性各有差异，因此筛选菌株也应从多方面综合考虑[20,39]。考虑到自然条件的不可控性，筛选获得的6 株耐低温多功能植物根际促生菌对于生长在高寒草地植物的实际促生效果还需进一步的研究与验证。

4 结论

选取的18 株菌有14 株菌在低温条件下均具有固氮、溶磷和分泌植物生长激素IAA 的能力。经过特性测定，综合比较获得6 株优良PGPR，其中菌株LPA7、菌株LNA2 溶有机磷和溶无机磷能力最强，菌株CND1 固氮能力最好，菌株LMJ2 分泌IAA 能力最强，菌株LMG2 拮抗病原真菌G.acuminata效果最好。 6 株优良耐低温菌株被鉴定为：菌株LMG2和LMJ2 为P.piscium，菌株LMY8 为P.kairouanensis，菌株CND1 为猴假单胞菌(P.simiae)，菌株LNA2、LPA7 为P.neuropathica。6 株优良耐低温菌株可为后续制作适用高寒草地的微生物菌剂提供优质菌株资源。