褪黑素抑制人血管平滑肌细胞的巨噬样表型转化

李双, 谭翠钰, 侯连杰, 赵国军

1.大理大学,云南大理 671003;2.广州医科大学附属第六医院清远市人民医院,广东清远 511518

心血管疾病的病理基础为动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)[1],血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在As发生发展中发挥重要作用[2]。随着单细胞测序技术和细胞谱系追踪技术的发展,发现VSMC至少包括6种不同亚型,除了所熟知的收缩表型外,还包括间充质样、巨噬细胞样、成纤维细胞样、成骨样和脂肪细胞样表型[3],提示VSMC表型转化在As发生发展过程中发挥重要且复杂的调控作用。

遗传谱系追踪研究表明,小鼠As斑块中约30%的泡沫细胞来源于VSMC,该比例在人类斑块中超过40%[4]。水溶性胆固醇负荷导致小鼠原代主动脉VSMC获得巨噬样细胞表型,其特征是VSMC标志物表达降低、巨噬细胞标志物上调和脂质吞噬能力增加,细胞发生泡沫化[5]。通过抑制小鼠VSMC的巨噬样表型转化,能显著减少小鼠As斑块泡沫细胞数量并增加纤维帽厚度,增强斑块稳定性[6]。褪黑素是由松果体分泌的一种激素,可从调控巨噬细胞极化[7]、降低内皮细胞炎症反应[8]和抑制VSMC增殖和成骨分化[9]等多方面发挥抗As作用,但褪黑素在VSMC巨噬样表型转化过程中的作用未见报道。本研究检测了褪黑素对VSMC巨噬样表型转化相关标志基因表达和细胞脂质吞噬能力的影响,并观察了褪黑素在VSMC表型转化所涉及细胞增殖和迁移中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国GIBCO公司,油红O、水溶性胆固醇(胆固醇∶甲基-β-环糊精复合物)和褪黑素为美国Sigma公司产品,CCK-8试剂盒购于南京建成公司,RNA提取、反转录和定量PCR相关试剂均购于TAKARA公司。

1.2 细胞培养

人VSMC系(PCS-100-012)购自ATCC公司。VSMC分为对照组、胆固醇组(水溶性胆固醇)、褪黑素组(水溶性胆固醇+褪黑素)。细胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,在37 ℃、5%CO2空气中培养。将VSMC按4×105个/孔接种于6孔板,细胞达80%汇合后,胆固醇组使用终质量浓度10 mg/L水溶性胆固醇处理细胞72 h,每24 h换1次培养基,保证水溶性胆固醇的终质量浓度以诱导血管平滑肌细胞的巨噬样表型转化和细胞泡沫化。褪黑素组使用0.5 μmol/L褪黑素与10 mg/L水溶性胆固醇共同处理血管平滑肌72 h。

1.3 CCK-8测定细胞活力

将VSMC按1×105个/孔接种于96孔板中,贴壁生长12 h后,分别用5、10、50、100 mg/L水溶性胆固醇或0.5、5.0、50.0 μmol/L褪黑素分别处理VSMC 72 h,去除细胞培养基,PBS清洗3次,每孔加入90 μL完全培养基+10 μL CCK-8溶液孵育4 h,酶标仪测定450 nm处光密度值。

1.4 定量PCR检测相关基因表达

按照TAKARA公司RNA提取和反转录试剂盒操作说明,提取VSMC总RNA,反转录为cDNA,用于后续定量PCR实验。参考本团队前期文献[10]实验操作,进行实时荧光定量PCR,相关基因引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 油红O染色

接种于6孔板的VSMC在不同因素处理后,PBS清洗2次,500 μL 4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次。然后每孔加入500 μL油红O工作液,避光染色30 min。去除油红O工作液,通过500 μL/孔60%异丙醇分化10 s,迅速加入1 mL PBS清洗3次。最后,每孔加入500 μL苏木精染色液染色5 min,用1 mL PBS清洗3次,将细胞置于倒置显微镜下观察、拍照。

1.6 Edu检测细胞增殖

将VSMC以1×105个/孔接种于24孔板,VSMC在不同处理条件下达到70%汇合后,使用BeyoClick EdU-488细胞增殖检测试剂盒进行检测。将细胞置于倒置显微镜下观察、拍照,随机挑选若干视野拍照,统计视野中Edu阳性细胞率(%)=Edu阳性细胞数/全细胞数×100%。

1.7 细胞划痕实验

接种于6孔板的VSMC在不同处理条件下达到90%汇合后,用10 μL移液器枪头在孔内竖直划擦,DMEM高糖培养液洗涤细胞,去除悬浮细胞后照相,用不含FBS的DMEM高糖培养液继续培养。划痕后第18 h与36 h分别在镜下观察划痕处细胞迁移状态,并拍照。细胞迁移率通过Image J软件测量计算。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 褪黑素逆转水溶性胆固醇诱导的VSMC的巨噬样表型相关标志基因表达

CCK-8实验结果表明:≤50 mg/L水溶性胆固醇对VSMC活力无影响;≤5.0 μmol/L褪黑素对VSMC活力无明显毒性(P>0.05;图1A和B)。本研究后续实验选择10 mg/L水溶性胆固醇和0.5 μmol/L褪黑素。

图1 褪黑素和水溶性胆固醇对VSMC巨噬样表型转化相关标志基因表达的影响A和B为CCK-8实验;C为定量PCR实验(n=3)。

定量PCR检测结果表明:10 mg/L水溶性胆固醇处理显著降低平滑肌收缩表型相关标志基因α-actin和α-tropomyosin的mRNA水平,并显著升高巨噬细胞相关标志基因CD68和MAC2的mRNA水平;而0.5 μmol/L褪黑素可逆转上述趋势(P<0.05;图1C),提示褪黑素可抑制血管平滑肌巨噬样表型转化相关基因表达。

2.2 褪黑素抑制水溶性胆固醇诱导VSMC脂质蓄积

油红O染色结果显示:水溶性胆固醇显著增加VSMC脂质蓄积,但褪黑素处理后可逆转水溶性胆固醇对VSMC脂质蓄积的诱导作用(图2)。

图2 油红O染色评估褪黑素和水溶性胆固醇对VSMC脂质蓄积的影响(n=3,400×)

2.3 褪黑素抑制水溶性胆固醇诱导的VSMC增殖

Edu染色结果显示:水溶性胆固醇增加VSMC Edu阳性率(P<0.05),而褪黑素降低胆固醇引起的VSMC Edu阳性率增加(P<0.05;图3),提示褪黑素显著抑制水溶性胆固醇引起的VSMC增殖。

图3 褪黑素抑制水溶性胆固醇诱导的VSMC增殖(n=3,200×)

2.4 褪黑素对水溶性胆固醇诱导的VSMC迁移无影响

与对照组相比,胆固醇组18 h和36 h细胞迁移率显著增加(P<0.05),而褪黑素不能减缓水溶性胆固醇共处理引起的细胞迁移率升高(P>0.05;图4)。

图4 褪黑素对水溶性胆固醇诱导的VSMC迁移无影响(n=3,40×)

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种由动脉血管内脂质聚积引起的慢性炎症性疾病,胆固醇诱导的血管平滑肌细胞巨噬样表型转化与动脉粥样硬化易损斑块形成密切相关,但是目前其分子机制尚未完全阐明。因此,解析VSMC的巨噬样表型转化分子机制并探寻相关治疗药物,对于动脉粥样硬化早期治疗及预防不良心血管事件发生具有重要意义。

水溶性胆固醇也叫胆固醇∶甲基-β-环糊精复合物。Rong等[11]研究结果表明,10 mg/L水溶性胆固醇处理小鼠主动脉平滑肌细胞72 h可诱导细胞发生巨噬样表型转化,表现为VSMC标志基因α-actin和α-tropomyosin表达显著降低,巨噬细胞标志基因CD68和MAC2表达显著增加,且油红O染色结果显示VSMC脂质吞噬能力增强。之后,Shankman等[6]也使用水溶性胆固醇处理VSMC,诱导其发生巨噬样表型转化,生成泡沫细胞。然而,前期关于水溶性胆固醇诱导VSMC出现巨噬样泡沫细胞表型的相关实验模型为原代小鼠主动脉平滑肌细胞,目前尚无水溶性胆固醇处理人VSMC巨噬样表型转化的相关报道。本研究先通过CCK-8细胞活力检测实验,评估水溶性胆固醇的细胞毒性,发现≤50 mg/L水溶性胆固醇对VSMC活力无影响,且10 mg/L水溶性胆固醇处理即可降低平滑肌收缩表型相关标志基因表达,并升高巨噬细胞相关标志基因表达,此外10 mg/L水溶性胆固醇处理增强血管平滑肌细胞脂质蓄积,提示水溶性胆固醇可诱导人VSMC巨噬样表型转化。

VSMC转分化为巨噬样细胞过程与VSMC增殖和迁移过程密切相关。VSMC去分化生成间充质样细胞,随后发生增殖和迁移。在受到不同刺激后,间充质样细胞可分别向巨噬细胞样、成纤维细胞样、成骨样或脂肪细胞样表型转化[3]。褪黑素是色氨酸代谢的产物,由松果腺按照昼夜节律分泌;近年来研究表明,褪黑素通过调控巨噬细胞极化和降低内皮细胞炎症反应等多方面发挥抗动脉粥样硬化的作用[12];因此,本文也观察了褪黑素对VSMC增殖和迁移的影响,以进一步阐释褪黑素调控VSMC表型转化的机制。有研究表明,在ApoE-/-小鼠中,褪黑素通过抑制VSMC炎症反应和增殖,减缓小鼠As进展[13],这与本研究发现0.5 μmol/L褪黑素可逆转水溶性胆固醇诱导的VSMC增殖的结果一致。另有研究表明,在胆囊癌中褪黑素通过抑制细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路,可抑制癌细胞迁移和侵袭[14],然而本研究中并未发现褪黑素有抑制VSMC迁移的作用,这种差异的具体原因还不清楚,可能是由于细胞系不同造成。

综上所述,本研究结果表明褪黑素可抑制VSMC巨噬样表型转化。