银杏叶有效成分提取的放大研究*

王 博，王子涵，段博文，刘旭琦，冯 俊，黄卫东

(1 湖北理工学院，湖北 黄石 435000；2 定颖电子(黄石)有限公司，湖北 黄石 435000；3 武汉科技大学，湖北 武汉 430081)

在银杏叶中至今已经被检测出近四十种黄酮类化合物。大多数黄酮化合物是具有固定形状的结晶体，但也有少数一些是无定型的粉末态。大多数黄酮化合物之所以显酸性，能溶于碱性溶液，是因为在分子中含有酚羟基，它们的酸性强弱与酚羟基的数量及位置有很大关系[1-3]。在本研究中，实验是以乙醇水溶液对黄酮的较好的提取率为根据。利用乙醇对银杏叶黄酮提取。利用紫外分光光度法测定提取物的总黄酮含量。小型实验，利用控制单因素温度、时间、液固比、粉碎度这四个单因素，探究了其对银杏叶总黄酮的提取率的影响。使用这四个条件设置了响应面优化。在小试实验的基础上，利用10 L多功能提取罐对整个实验进行中试放大，探讨银杏叶有效成分提取工业化生产工艺。

1 实 验

1.1 药品与仪器

实验所用银杏叶采自湖北理工学院校内种植的银杏树，采摘时间是9-11月。直接将其从树上采摘，采摘后避光、透风晾晒，后40 ℃烘干。破碎成粉末状，过40目筛。

主要实验药品有亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、分析乙醇、95%乙醇，天津市凯通化学试剂有限公司；芦丁，西安汇林生物科技有限公司。

实验仪器有HH-S1数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；XFB-500高速中药粉碎机，吉首市中诚制药机械厂；DZF-6050真空干燥箱，上海申光仪器仪表有限公司；SPECORD-S600紫外分光光度计，德国耶拿分析仪器有限公司；DC-TQ 10 L多功能提取罐，上海达程实验设备有限公司。

1.2 银杏叶中总黄酮含量的单因素实验

本实验使用紫外分光光度法利用芦丁为黄酮化合物对照品，对黄酮类化合物进行最大吸收波长510 nm测定吸光度[4]。并得到其标准回归方程。

称取5.0 g银杏叶粉，将其置于圆底烧瓶中，以95%乙醇为提取剂在不同的提取温度、提取时间、提取液固比、原料粉碎度下进行冷凝回流提取。待提取液冷却后，抽滤，记录滤液体积。取部分澄清的液体离心分离。转速3 500 r/min，时间为20 min。用移液管取上清液1.0 mL，测其吸光度，得到黄酮含量。

1.3 响应面分析法放大优化实验

放大实验在10 L多功能提取罐进行实验。先将多功能提取罐中提取剂的温度提升至反应所需温度，再将300 g过40目的银杏叶粉加入提取罐中。提取结束，应冷却充分后再过滤。量其体积，取上清液离心，用移液管取上清液1.0 mL，然后得出提取率。依据单因素温度、时间、液固比进行优化。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线测定

使用移液枪精密移1.5 mg/mL芦丁溶液。量为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL。将其分别移至10.0 mL容量瓶定容，编号1、2、3、4、5、6、7。各取1 mL溶液，至10.0 mL容量瓶，加入5% NaNO2溶液0.3 mL。震荡均衡，静置6 min。注10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL。摇荡均衡，静置6 min。末尾注4%NaOH溶液4 mL，以60%乙醇溶液定容，静置17 min。用编号1管作空白对照。测其510 nm处吸光度。利用其吸光度、浓度绘制曲线，并得到其标准回归方程，回归方程为y=6.509 5x-0.013 1，R2=0.992。

2.2 单因素实验

图1是不同因素对银杏叶总黄酮含量的影响。由图2a可以看出，在温度处在60～75 ℃时，提取率在缓慢上升，说明在这个阶段，提取的温度对提取率的影响不是非常剧烈。在75 ℃以后，提取率急剧下降。温度太高时，黄酮失活，提取率下降。图2b中，在70 min时其提取率有将近一个百分点的增长，这说明在60～70 min这10 min之间，银杏细胞深处的黄酮被提取出来，使得提取率在这十分钟内有了小幅度提升。在70 min之后，提取率开始急剧下降，这说明长时间的提取会使原料中的银杏叶总黄酮氧化分解，黄酮的结构被破坏，导致提取率降低。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin of absorbance

图2 小试实验不同因素对提取率的影响Fig.2 Response chart of single factor in small experiment

在液固比小时(见图2c)，银杏叶总黄酮的提取率在迟缓的增加。这说明在较少的溶剂的提取下，银杏叶粉中的总黄酮有一部分未进入在溶剂中。在液固比达到11∶1时，最大限度的溶解了银杏叶粉中的总黄酮。后再增加液固比，总黄酮提取率下降。由图2d可以看出，60～80目以上的粉碎度后，黄酮的提取率逐渐上升。在100～120目时达到最大值，120目以上的部分又出现了黄酮提取率的下降。这有可能是由于其粉碎度过高导致银杏叶粉对溶剂的吸附能力偏大，致使其提取率下降。

2.3 响应面分析法放大优化实验

响应面分析法(RSM)，是统计学与数学两相结合的产物。响应面分析的主要过程包括三大部分：实验的前期设计、响应面数据分析以及响应面的优化计算。可以得出最佳的实验条件。

由图3和图4可以看出，小试实验与中试放大实验的反应最优因素具有相同的趋势。提取温度，时间和液固比等条件在小试实验以及中试试验中都达到了最优点，这表明这几个实验条件有现实的放大意义。不过，小试与放大实验的不同点是：放大实验的提取率和小试相比，在相同条件下，没有小试的提取率高，其原因可能是因为中试放大试验的反应系统较大，无法像小试实验的反应均衡，因此导致中试放大的提取率比小试要低。当然，在大规模生产时，可以采用较低能耗的普通条件进行生产，可以在提取率相差不太大的情况下极大地节省反应成本，增加经济效益[5-7]。

图3 小试实验不同交互因素对提取率的响应面图Fig.3 Response chart of the interaction of factors in small experiment

由图5中试放大实验响应面关系分析可知，残差与方程预测值对应关系分布分散性好，呈现无规律(图5a)；实验实际值与预测值对应关系(图5b)分布在一条直线上。通过回归模型进行最优条件的预测，综合考虑工业生产中的实际情况及操作过程，获得提取的最佳条件：提取温度为75 ℃，提取时间为70 min，提取液固比为11∶1。在此条件下，预测的提取率值理论上可达到12.03%。

图5 中试实验响应面实验分析Fig.5 Analysis of response chart in pilot tests

3 结 论

本实验通过小试进行了乙醇提取银杏叶总黄酮的最佳因素。参照该因素进行放大响应面分析优化研究，为大型生产提供数据。中试放大实验响应面最优条件为：75 ℃，70 min，液固比11∶1，提取率最高到达12.03%。中试放大实验是在模拟工业化生产，给银杏叶黄酮的大规模生产供了一个科学、准确的数据支撑。实验使用乙醇做为提取溶剂是考虑到乙醇无毒无害，易于回收的特点。其提取过程中操作过程较为安全、不会污染环境，其提取出的黄酮安全系数高，可以达到作为食品添加剂的标准。