固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离BPA*

王 丹

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

多年的研究表明，环境中的许多化学物质对人体和动物的内分泌系统具有干扰作用。双酚A(BPA)就是其中的一种，它是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，由于其在多种包装材料中的广泛使用，又是环境雌激素的一种，已成为研究和监测的重要物质[1]。目前最为广泛应用的对BPA的分析技术是气相色谱-质谱联用技术和液相色谱等[2-3]。这些检测方法大多需要复杂的前处理过程[3]，采用毛细管电泳分析方法可以对复杂样品直接进行分析，方法快速、绿色环保。胶束电动色谱法(MEKC)分析BPA[4-6]等中性化合物的方法己有报道。但是，MEKC法对样品的浓度检出限仍偏高。为实现复杂环境水样中痕量酚类污染物的MEKC法分离检测，发展改善MEKC法浓度检出限的富集技术十分必要。MEKC法样品富集技术可以分为离线富集和在线富集[7-13]。在线富集方法在一定程度上受到进样体积的限制，富集倍数是有限的[10]，另外缺少某些离线富集技术所具有样品净化功能。在MEKC法离线富集技术中使用最广的是固相萃取[14]，不但可以在一定程度上改善MEKC法的浓度检出限，还可以结合样品处理本身的优势，起到样品净化功能。笔者在之前的研究中，用β-环糊精键合硅胶(CDS)作选择性吸附剂和1-金刚烷酸作顶替洗脱剂对双酚A的样品水溶液进行SPE处理，收集下的洗脱溶液直接进行MEKC法分析的方法，在对分析物富集和样品净化方面收到较好效果[15]。在之后的研究中建立了一种改进的样品堆积MEKC富集分离方法从而对分析物起到富集效果[16]。本文在前面研究的基础上，将固相萃取与样品堆积相结合，以期进一步改善毛细管电泳浓度检出限，拓宽毛细管电泳对复杂环境样品中痕量酚类污染物的分析应用。

1 实 验

1.1 主要仪器与试剂

CE-L1毛细管电泳仪，新加坡CE Resources公司；UVIS 200紫外检测器，美国Alltech公司；涂层熔硅弹性石英毛细管(内径为50 μm，柱长为61 cm，有效柱长为50 cm)，河北永年光纤厂；pH-3C酸度计，江苏江分电分析仪器厂；KQ218超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；ABi04-N电子分析天平，感量值为0.1 mg，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；尼龙滤头(0.45 μm)，上海泉岛技术公司；微型注射器(1 mL)，中国上海医疗器械集团。β-环糊精(β-CD)(分析纯)，美国Sigma公司；1-金刚烷酸、双酚A(BPA)、辛基酚(4-OP)、壬基酚(4-NP)(分析纯)，美国Aldrich公司；氢氧化钠、甲醇、乙腈、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸(分析纯)，上海医药集团试剂公司；十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯)，上海豪绅化学试剂有限公司；β-环糊精键合桂胶(CDS)，实验室自己合成；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 溶液配制

标准贮备溶液：取适量双酚A、辛基酚和壬基酚，用甲醇作为溶剂，取适量配制成1 000 mg/L的混合标准贮备溶液。

样品溶液：用二次蒸馏水将混合标准贮备溶液稀释成含双酚A、辛基酚和壬基酚各2.0 mg/L的混合溶液。

0.05 mol/L 1-金刚烷酸溶液：将1-金刚烷酸溶于0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中，再用盐酸调节pH值至7.0。

0.1 mol/L 1-金刚烷酸溶液：将1-金刚烷酸溶于0.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，再用氢氧化钠稀释至所需的体积。

标准工作溶液的配制：

BPA标准贮备溶液：取适量双酚A，用甲醇作为溶剂，配制成1 000 mg/L的标准贮备溶液。

BPA系列标准工作溶液：移取0.1 mL BPA标准贮备溶液于100 mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容至刻度线，混合均匀，配制成浓度为1 mg/L的标准工作溶液。移取1 mg/L的标准工作溶液，然后用二次蒸馏水稀释成浓度均分别为0.005，0.01，0.02，0.04，0.08 mg/L的系列标准工作溶液。

1.3 离线SPE萃取小柱的制作

以医用1 mL聚丙烯注射器制作萃取小柱。将适量脱脂棉以甲醇润湿后置于注射器前端，以玻棒压紧。取30 mg β-环糊精键合桂胶，以甲醇匀浆后注入注射器中，挤出填料及脱脂棉中的气泡，使填料填充均匀无沟流产生。制作好的小柱在使用前需以甲醇和水充分活化。

1.4 SPE过程

制作好的小柱在使用前，先用4 mL的甲醇和4 mL的二次蒸馏水以2 mL/min的速度进行冲洗。小柱在活化时和后续的萃取中均应保持存有液体。将150 mL待测样品溶液通过萃取小柱，之后用3 mL的0.05 mol/L l-金刚烷酸溶液洗脱溶质。用1.5的MEKC方法测定洗脱出的溶质浓度。

1.5 MEKC操作条件

用0.025 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)溶解0.02 mol/L的SDS，同时加入5%的乙腈和0.001 mol/L β-CD，溶液经过0.45 μm滤头过滤后，得到MECK缓冲溶液。采用压力进样方式(2.07 kPa)，进样8 s，分离电压为20 kV，检测波长为214 nm，实验温度为25 ℃。

2 结果和讨论

2.1 SPE洗脱溶剂的优化

将10 mL 2.0 mg/L的BPA 样品溶液通过固相萃取柱后，分别用3 mL含5%，10%、15%、20%乙腈的0.05 mol/L 1-金刚烷酸溶液进行洗脱，采用1.5 MEKC条件进行测定，并计算样品回收率，考察1-金刚烷酸中不同体积分数乙腈的加入，对β-环糊精键合硅胶(CDS)所保留BPA回收率的影响，结果见表1。由表1可知，加入10%乙腈时样品的萃取回收率最高，其原因可能是由于未键合上环糊精的硅胶对样品有少量的保留，乙腈对这部分的样品的洗脱有利。但是加入过多的乙腈时就会减弱1-金刚烷酸的洗脱效率。因此选择加入10%乙腈的0.05 mol/L 1-金刚烷酸溶液作为分析样品溶液的洗脱溶剂。

表1 0.05 mol/L 1-金刚烷酸洗脱液中加入乙腈时BPA的萃取回收率Table 1 Recoveries of BPA in eluate from the CDS with the eluting solution of 0.05 mol/L l-adamantanecarboxylate containing acetonitrile

2.2 CDS装柱用量的选择

萃取柱中CDS的用量会影响到洗脱溶液用量。在固相萃取柱内分别装入10、20、30、40、50 mg的CDS，再将10 mL BPA(2.0 mg/L)样品溶液通过各固相萃取柱，之后用3 mL的含10%乙腈的0.05 mol/L 1-金刚烷酸溶液洗脱溶质，再用1.5 MEKC检测并计算回收率，结果列于表2。由表2可知，装入30 mg CDS时的萃取回收率最高。因此在分析样品溶液时固相萃取的CDS用量为30 mg。

表2 在固定3 mL洗脱溶液条件下不同CDS用量时BPA的萃取回收率Table 2 Recoveries of BPA with the SPE cartridges packed with different amount of CDS using 3 mL of the eluting solution

2.3 固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离BPA的方法研究

取30 mg CDS制作萃取小柱，使用前先用4 mL的甲醇和4 mL的二次蒸馏水以2 mL/min的速度冲洗小柱。小柱在活化时和后继的萃取中均应保持存有液体。将150 mL待测液通过萃取小柱，之后用3 mL含10%乙腈的0.05 mol/L的1-金刚烷酸洗脱液洗脱溶质。洗脱出的溶质在进样之前先进一段0.1 mol/L的1-金刚烷酸，再进样品溶液。按1.5 MEKC操作条件进行分析。

2.3.1 置换塞进样时间的优化

SPE过程使用含1-金刚烷酸的洗脱液进行洗脱，样品中含1-金刚烷酸可能会对改进的样品堆积富集过程产生影响。试验对1-金刚烷酸的进样时间进行了优化，设置进样压强为2.07 kPa，1-金刚烷酸塞子进样时间为4、6、8、10 s，然后再进2.0 mg/L的BPA样品溶液，考察在进样品溶液60 s条件下BPA峰高的变化。结果发现，1-金刚烷酸进样6 s时BPA的峰高最高，峰型对称；塞子进样8 s和12 s时峰展宽严重，严重影响分离效率。样品中含1-金刚烷酸并未影响 BPA的检测。所以在固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离BPA 时确定1-金刚烷酸进样时间为6 s。

2.3.2 样品进样时间的优化

取2.0 mg/L的BPA样品溶液，设置进样压强为2.07 kPa，考察进样时间为60、90、120 s时，对富集效率(以峰高计)的影响。试验结果发现，随着进样时间的加长，峰髙增加。但在进样90 s和120 s时，BPA电泳峰呈现平顶状，说明BPA的进样体积已过载。所以在固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离BPA 时选择进样时间为60 s。

2.3.3 固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离BPA的方法评价

采用固相萃取CDS装柱量为30 mg，用含10%乙腈的0.05 mol/L 1-金刚烷酸溶液作为洗脱溶剂，洗脱流速控制在2 mL/min，置换塞进样时间为6 s，样品溶液进样时间为60 s，进行MEKC分析。图1曲线B是BPA、4-OP和4-NP样品混合溶液(各20 μg/L)固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离电泳谱图。图1曲线A 是BPA、4-OP和4-NP样品混合溶液(各2.0 mg/L)直接进样未经固相萃取和在线富集的MEKC谱图。从图1曲线B中未能观察到4-OP和4-NP，说明此方法不适用于4-OP和4-NP富集，可能是在SPE过程中采用3 mL的洗脱液未能洗脱4-OP和4-NP的结果，图1说明固相萃取和样品堆积耦联MEKC方法不但可以对BPA进行富集，还可以对分析样品进行净化。试验结果可知，对BPA可以实现300倍左右的富集效果(以峰高计)。

图1 固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离谱图Fig.1 Electropherograms obtained in the MEKC

取配制好的系列标准溶液，采用此富集方法进行分析，以BPA的浓度(x)为横坐标，以色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，在0.005～0.08 mg/L浓度范围内，BPA的浓度与色谱峰面积之间存在良好的线性关系，线性方程为y=187.71x-0.008 9，线性相关系数为0.996 4，检出限为2 μg/L(S/N>3)。

2.4 实际水样加标实验

将取自伟长湖的水经过0.45 μm的微孔滤头过滤后分为三部分，一部分水样直接进行胶束电动色谱分析检测；还有一部分水样经固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离检测分析，最后一部分加入BPA标样配制成浓度为2 μg/L的样品溶液，采用同样的固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集分离检测分析。 从图2可见在实际湖水样加标分析检测时，可以检测到2 μg/L的BPA峰和一个很高的实际湖水样未知物峰，在伟长湖中没有检测到BPA。采用此联用方法对BPA做了实际水样的加标回收与精密度实验，每个加标浓度水平平行测定6次，结果见表3。

图2 实际湖水固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集检测电泳谱图Fig.2 Electropherograms of a real lake water sample obtained in the SPE-stacking MEKC

表3 BPA的实际水样加标回收与精密度试验结果Table 3 Recoveries of BPA in the spiked real water samples

3 结 论

实现了离线富集技术固相萃取和在线富集技术改进的样品堆积与MEKC的耦联。采用此固相萃取和样品堆积耦联MEKC富集检测分析方法，进一步改善了MEKC对BPA的浓度检出限，最低检出限为2 μg/L，实现了约300倍的富集效果(以峰高计)，相对标准偏差为10%(n=6)。体现了SPE和MEKC技术结合的优点，显示出固相萃取和样品堆积耦联MEKC方法不但可以起到对BPA进行富集的目的还可以实现对分析样品进行净化的作用。此方法有望用于环境水样中某些痕量污染物的分析检测。