HPLC法测定聚维酮碘消毒颗粒中聚维酮K30的含量

李星余，高 洋，马亚美，孙文霞

(成都大学药学院，四川 成都 610106)

2019年来，新冠病毒肺炎疫情席卷全球，导致大量人员死亡，因而各类消毒剂广泛用于公共场所以及家庭的新冠病毒肺炎预防。有文献研究[1-3]聚维酮碘(PVP-I)可以快速灭活冠状病毒，并有效减少急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2)的医院传播。PVP-I是元素碘和表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)结合而成的疏松复合物(见图1)，对于细菌、真菌、病毒、原虫等都有良好的杀灭作用，不仅可用于外科消毒，还可用于治疗烧烫伤、皮肤溃疡、妇科疾病以及预防与辅助治疗性病等。

图1 聚维酮碘结构式Fig.1 Structure formula of povidone iodine

PVP-I确切的抗菌机制尚未完全明确，应与其能快速穿透微生物细胞壁的能力有关。Schreier等研究发现PVP-I对细菌细胞蛋白和酶的结构和功能有影响，可以通过阻断氢键和改变细胞膜结构来损害细胞功能(见图2)[4]。PVI-I的多重作用机制可以使其能够快速杀死微生物和阻止细菌耐药性的出现。由于其抗菌活性与一些对细胞壁的直接毒性作用相关，而不是通过特定的分子途径(如抗生素)，耐药性的发生可能性不大，也鲜有报道。其中PVP起载体和助溶作用，它是一种类似人体血浆蛋白的高分子聚合物，性质稳定，无毒、无臭、无味，具有极好的成膜、粘合、解毒降毒和缓释的功效。PVP通过氢键能与碘的分子紧密络合，有效降低了碘的腐蚀性和刺激性。目前市场上已有聚维酮碘溶液、凝胶剂、栓剂和软膏剂等几种剂型。笔者制备了PVP-I消毒颗粒，携带方便，以适用于野外受伤应急处理。为了更好的控制本品的质量，本研究建立了高效液相色谱法测定本品中PVP的含量。

图2 聚维酮碘的作用机制Fig.2 Mechanism of povidone iodine

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters empower 3液相工作站，沃特世公司；赛多利斯BS224S型万分之一天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-300E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；UPT-II-10T优普超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

1.2 试药与试剂

聚维酮K30对照品(批号：BCCF-2694，由Sigma公司提供)，聚维酮碘颗粒(批号：210101，210102，210103，规格：5 g/包，四川大学提供)，乙腈为色谱纯(诺尔施公司提供)；水为蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性

色谱柱为Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，i.d 5 μm)；流动相为乙腈-水(8∶92)；检测波长为210 nm；流速为0.8 mL/min；进样体积为20 μL；柱温为室温。理论板数按聚维酮K30计算应不低于3 000。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液

取本品10包，混匀研细，称取细粉80 mg，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加水适量超声使溶解，放至室温，用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液

取聚维酮K30对照品60 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水适量超声使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。

2.2.3 空白辅料溶液

按处方量，称取空白辅料适量，置100 mL容量瓶中，加水适量超声使溶解，放至室温，用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.3 方法专属性

分别取空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液各20 μL，照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图3。结果表明：聚维酮K30的保留时间约为3.5 min，流动相和辅料在主峰处无干扰，聚维酮K30与相邻杂质峰的分离度大于1.5，符合测定要求，本方法的专属性良好。

图3 空白辅料溶液(A)、聚维酮K30对照品溶液(B)和供试品溶液(C)的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of blank adjuvant solution (A)，plasdone K30 reference substance solution (B)and sample solution (C)

2.4 线性关系考察

取聚维酮K30对照品适量，精密称定，用蒸馏水溶解制备成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的系列工作溶液。照“2.1”项下色谱条件，注入色谱仪，并记录色谱图。采用最小二乘法将峰面积(y)对溶液浓度(x)进行线性回归，得回归方程为：y=34 459x-199.07 (r=0.999 9)，见图4。 结果表明：在0.05～1.0 mg/mL浓度范围内，聚维酮K30的浓度与峰面积线性关系良好。

图4 标准线性图Fig.4 Standard linear diagram

2.5 准确度试验

取空白辅料，按处方量加入聚维酮K30对照品适量，用蒸馏水制成低、中、高三种浓度(0.48、0.60、0.72 mg/mL)的聚维酮K30工作也溶液，每个浓度平行制备3份，按外标法分别测定并计算低、中、高三种浓度的回收率及RSD。结果(见表1)表明高、中、低3个浓度的回收率为98.18%～101.88%，RSD为0.61%～1.34%，符合测定要求，本方法的准确度良好。

表1 回收试验结果Table 1 Results of recovery test

2.6 精密度试验

2.6.1 进样精密度

取聚维酮K30对照品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，峰面积分别为20 398、20 541、20 419、20 455、20 353 、20 241，峰面积的RSD为0.49%(n=6)，表明仪器进样精密度良好。

2.6.2 重复性试验

取本品(批号：210101)，按照“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，精密量取20 μL注入色谱仪，并记录色谱图，按外标法计算样品中聚维酮K30的含量。6份样品中聚维酮K30的百分含量分别为62.65%、61.98%、 62.13%、 62.52%、63.11%、62.92%，RSD为0.70%(n=6)，表明本方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，将供试品溶液放置室温条件下，于不同时间(0、1、2、3、4、6、8 h)分别进样20 μL，记录峰面积并计算RSD。结果不同时间点的峰面积分别为17 270、17 362、17 431、17 376、17 078、17 329，RSD为0.72%(n=7)，结果表明供试品溶液在室温条件下放置8 h稳定性良好。

2.8 耐用性试验

分别改变色谱柱品牌(Welchrom C18：4.6 mm×200 mm，5 μm、Kromasil C18：150 mm×4.6 mm，5 μm、Hypersil C184.6 mm×250 mm，5 μm)、流动相流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)、检测波长(205 nm、210 nm、215 nm)，其他色谱条件不变，评估测定条件发生微小变动时测定结果不受影响的承受程度。结果在不同品牌色谱柱条件下，聚维酮K30的测定含量分别为62.92%、62.95%和62.32%，RSD为0.64%(n=3)；在不同流速条件下的平均含量分别为61.32%、62.32%和60.48%，RSD为1.22%(n=3)；在不同波长条件下的平均含量分别为61.20%、62.32%和60.42%，RSD为1.97%(n=3)。结果表明本方法的耐用性良好。

2.9 样品含量测定

取3批聚维酮碘颗粒样品，照“2.1”项下色谱条件测定，并按外标法计算每批样品中聚维酮K30的含量。结果各批样品中含聚维酮K30的含量分别为60.90%、60.50%、61.22%。

3 结 论

随着局部和全身性抗生素的耐药性不断增加，越来越多的证据表明[5]，局部皮肤感染应优先使用消毒剂而不是局部和全身性抗生素治疗。作为局部伤口治疗的替代品，消毒剂往往对微生物具有杀灭作用，并且比抗生素具有更广泛的抗菌活性。此外，与大多数抗生素相比，消毒剂针对微生物细胞生物学各个方面的多种作用机制而降低了出现耐药性的可能性。此外，世界卫生组织最近的一项指南提倡在围手术期使用良好的消毒剂[6]，同时减少全身性抗生素的使用。临床上理想的消毒剂应该具有以下性质如杀菌谱广，有效浓度低，穿透生物膜、坏死组织和焦痂的能力强，获得性抗性的发生率低，和良好的局部耐受性。在伤口护理中，仅少数消毒剂能够同时用于感染疾病的预防和治疗，其中就包括碘载体和聚乙烯吡咯烷酮碘。

PVP本身无抗菌作用，在生产过程中PVP形成微小包腔载体，将碘离子络合在微囊的腔体内，形成PVP-I，从而增加碘的溶解性，同时减少挥发性。另外，PVP对细胞膜具有亲和作用，能将碘直接引到细菌物胞表面，这对提高碘的抗菌活性有重要意义。目前测定PVP含量的方法包括紫外分光光度法[7]、排阻色谱法[8]等，存在灵敏度不高，操作过程繁琐等问题，因而笔者根据参考文献[9]，建立了HPLC-UV法测定聚维酮碘消毒颗粒中聚维酮K30的含量。取聚维酮K30对照品进行紫外扫描(200～400 nm)，在200～230 nm波长处有末端吸收，为减少辅料和其他溶剂的干扰，选用210 nm为检测波长。本试验进行了全面的方法学验证，建立了准确、可靠、专属性强的测定聚维酮碘颗粒中聚维酮K30的HPLC法，也为其他消毒制剂或药品中聚维酮K30的含量测定提供思路。