异亮氨酸对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和肠道微生物的影响

■ 刘尧君 雷 剑 赵小刚 谯仕彦 卞国志*

（1.广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心，广东广州 511400；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.清远海贝生物技术有限公司，广东清远 511853）

支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。支链氨基酸可以通过改善肠道发育[1-2]以及提高动物采食量[3]、营养物质消化率[4]、氨基酸利用率[5]和肌肉蛋白的合成[6]来促进动物的快速生长。

异亮氨酸是人和动物的一种必需氨基酸。因其具有支链结构的中性脂肪族氨基酸，故可以参与调节生物体内营养代谢和生长发育等重要的生理功能[7-8]。饲料中添加1%的异亮氨酸可通过改善断奶仔猪回肠屏障来预防腹泻的发生[9]。Goodarzi 等[2]发现异亮氨酸通过改善肠道菌群结构来促进断奶仔猪的生长。但当饲料中缺乏异亮氨酸时，会对育肥猪生长性能、胴体性状造成负面影响[10]。但关于异亮氨酸对断奶仔猪阶段的影响研究报道较少。因此，本试验通过在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的异亮氨酸，研究其对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和肠道微生物的影响，为提高断奶仔猪生长性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选用（28±2） d 断奶的杜×长×大健康仔猪180 头，初始体重（7.82±0.52） g，按照体重随机分为6 个处理，每个处理6个重复，每个重复5头仔猪，分别采食6 种添加不同水平异亮氨酸的试验饲粮。试验期为21 d。

1.2 试验设计及试验饲粮

饲粮参考NRC（2012）猪营养标准，试验饲组成及营养水平见表1，其中对照组饲粮粗蛋白水平18.50%，异亮氨酸水平为0.78%，其他各组饲粮蛋白水平均为18.50%，异亮氨酸水平依次为0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16%。

1.3 饲养管理

试验在广东海大集团高州猪场（中国广东）进行。试验采用全封闭猪舍，猪舍温度控制在（25±1） ℃、湿度维持在58%～74%。颗粒料饲喂，自由采食和饮水。按猪场常规管理程序进行驱虫和免疫，并观察、记录动物的健康状况。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

分别于试验开始和试验结束时以重复为单位对仔猪空腹称重，以重复为单位记录采食量，并计算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、饲料转化率（FCR）。

平均日采食量（ADFI，kg）=（给料量-余料量）/（试验天数×仔猪头数）

平均日增重（ADG，kg）=（末重-初重）/（试验天数×仔猪头数）

饲料转化率（FCR）=ADFI/ADG

1.4.2 粪样收集及处理

在试验第21天，每个处理组挑选6头体重一致的仔猪，收集新鲜的粪样，立刻置于液氮中冷冻。将收集的样品储存在-80 ℃冰箱。

1.4.3 血清采集

饲养试验结束时，试验猪禁食12 h，每个处理选取接近平均体重的猪，前腔静脉采血，静置0.5 h 后3 500 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，置于-20 ℃保存，用于检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL8）、白细胞介素-22（IL-22）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、干扰素-γ（INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脱氢酶（LDH）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、α-淀粉酶（α-AMY）、三酰甘油（TG）、胆固醇（CHO）。所用试剂盒均为南京建成生物工程研究所有限公司，检测方法均按照说明书要求操作和计算。

1.4.4 粪便微生物16S rRNA测定与分析

饲养试验结束时，用无菌防爆试管收集每只猪的新鲜粪便后迅速放于液氮中，用于微生物16S rRNA测定与分析。具体操作步骤如下。

① 新鲜粪便基因组DNA 的提取：吸取1 mL CABT 裂解液和1 g 样品置于2 mL 无菌EP 管，加入适量溶菌酶，涡旋1 min 使样品充分混合，65 ℃水浴10 min；12 000 r/min、4 ℃离心10 min 取上清，加入酚（pH 为8.0）∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）50 μL 上述条件离心10 min；取上清至1.5 mL 离心管，加入氯仿∶异戊醇（24∶1）50 μL上述条件离心10 min；取上清至1.5 mL 离心管，加入异丙醇，-20 ℃沉淀，上述条件离心10 min；弃上清，使用1 ml 75%乙醇洗涤2次，小心吸取上层液体，室温晾干；加入ddH2O溶解DNA；

② PCR扩增：提取的DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。使用引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）对V3～V4可变区进行PCR扩展，扩展体系如下。

模板：稀释后的基因组DNA（1 ng/μL）10 μL；引物：341F、806R（0.2 μmol/L），各1 μL；酶和缓冲液：Phusion Master Mix，15 μL；水：超纯水，2 μL；

PCR 反应程序为：98 ℃预变性1 min；30 个循环（包括98 ℃，10 sec；50 ℃，30 sec；72 ℃，30 sec）；72 ℃，5 min。扩展的PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测并割胶回收目标条带。

③ Illumina Novaseq 测序平台：使用Nova Seq 6000 PE250进行上机测序。

1.4.5 新鲜粪便微生物16S rRNA信息分析

将原始的fastq文件使用QIIME2处理，使用dada 2插件进行质控、修剪、去噪和拼接。去除嵌合体后，得到最后的特征序列表格；随后使用QIIME2-featureclassifier 将该特征序列比对到预先训练好的13.8 版本的GREENGENE 数据库，得到物种分类信息表；使用QIIME2-feature-table插件去除线粒体序列。

1.5 试验数据分析

采用SAS 9.4 软件对数据进行单因素方差分析，LSD 多重比较，结果以平均值表示，P＜0.05 表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪生长性能的影响

由表2可知，与0.78% Ile水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平对断奶仔猪的末重、平均日采食量、平均日增重和饲料转化率均无显著影响（P＞0.05）。当饲粮Ile 水平为1.01%时，仔猪末重最高，高于0.78% Ile 水平2.89%，但差异不显著（P＞0.05）。且饲粮Ile 水平为1.01%时，其饲料转化率为所有试验组中最低，但与其余各组差异不显著（P＞0.05）。

2.2 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

由表3 可知，与0.78% Ile 水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平对断奶仔猪血清T-AOC、SOD、GSH-Px 和MDA 均 无显著 差异（P＞0.05）。以上结果表明不同饲粮Ile水平对断奶仔猪血清抗氧化指标均无负面影响。

表3 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响（n=6）

2.3 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清免疫指标的影响

由表4可知，当饲粮Ile水平为1.01%时，血清IgA水平显著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16 Ile 水平（P＜0.05），但与0.78% Ile 水平无显著差异（P＞0.05）。饲粮Ile 水平为1.01%时血清IgA 水平高于其他各水平，表明饲粮中Ile 水平为1.01%时有利于提高断奶仔猪的免疫力。但饲粮Ile 水平对断奶仔猪血清中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ、IL-22 均无显著影响（P＞0.05）。以上结果表明饲粮Ile 水平为1.01%可以改善断奶仔猪的免疫功能。

表4 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清免疫指标的影响（n=6）

2.4 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清生化指标的影响

由表5可知，饲粮Ile水平为0.94%时，UREA水平显 著 高 于0.78% Ile 水 平（P＜0.05），但 与0.87%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平无显著差异（P＞0.05）。饲粮Ile 水平对机体氮代谢和糖类代谢指标均无显著影响（P＞0.05），表明饲粮Ile 水平对机体的氮代谢和糖类代谢均无作用。

表5 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清生化指标的影响（n=6）

2.5 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪肠道菌群的影响

由图1 可知，在门水平，断奶仔猪粪便菌群主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）和厚壁菌门（Firmicutes）这四种的菌群组成，其中拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌群，共占粪便菌群的90%以上。由图2 可知，在属水平，Ile 水平为0.94%时，富集到较多的羧酸菌属（Clostridium_sensu_stricto_1），norank_f_Muribaculaceae，螺旋体属（Treponema）；Ile 水平为1.01%时，与0.78% Ile 组相比，提高了有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的丰度。

图1 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪粪便菌群结构的影响（门水平）

图2 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪粪便菌群结构的影响（属水平）

3 讨论

3.1 饲粮异亮氨酸对断奶仔猪生长性能的影响

以玉米-豆粕型为基础的饲料配方中，一般不会出现Ile 的缺乏。当以血粉替代部分豆粕作为基础饲粮的蛋白质来源配制Ile 缺乏的饲粮时，随着饲粮Ile水平的提高，断奶仔猪和肥育猪的平均日增重、平均日采食量和肉料比显著提高[11-13]。Lordelod 等[14]发现在以玉米-小麦-豆粕型低蛋白饲粮饲喂断奶仔猪时，通过补充0.13% Ile 可以提高其生长速度。Ma 等[15]研究发现添加0.13% Ile 可以提高肉鸡的平均日采食量和平均日增重。本试验中，饲粮Ile 水平对保育仔猪的平均日采食量和平均日增重均没有产生显著影响。与罗燕红等[10]和邱磊[16]的研究结果一致。这可能是由于本试验采用的饲粮为玉米-豆粕型基础饲粮，没有设计出Ile缺乏的对照组。

3.2 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

刘恒晨[17]研究表明，饲粮中添加0.4% Ile 后显著提高了AA 肉鸡血清中GSH-Px 水平，增强了机体的抗氧化能力。宫碧霜等[18]发现，饲粮中添加0.5% Ile后显著提高了小鼠血清中T-GSH 活性并显著降低了MDA 含量，提高了小鼠机体的抗氧化能力。但Dong等[19]研究发现，给28 周龄的罗曼褐蛋鸡饲喂Ile 水平为0.56%、0.67%、0.78%、0.86%和0.96%饲粮12周，对其血液和肝脏中的T-AOC、SOD 和MDA 均无影响。本试验中，不同水平的Ile 并未改善断奶仔猪体内抗氧化功能。

3.3 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清生化指标的影响

血液生理生化指标可以反映机体生理机能及代谢状况。血清中TP、ALB、UREA、ALT 等是衡量机体氮代谢的主要指标。尤其是血清UREA 是蛋白质的代谢产物，其浓度可以准确地反映动物体内氨基酸合成蛋白质效率的高低，当蛋白质合成和饲料转化效率增加时，UREA 含量降低，反之则升高[20]。本试验中，随着饲粮中Ile水平的增加，UREA 含量呈现先升高后降低的趋势，表明Ile水平为0.94%不利于断奶仔猪蛋白质的合成和代谢。GLU、α-AMY 和LDH 是衡量机体糖代谢的主要指标。本试验中，Ile 的添加并没有引起这些指标的差异，表明Ile 对断奶仔猪糖代谢无显著调节作用。

3.4 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪血清免疫指标的影响

Ile 不仅是体内糖、脂及蛋白代谢的重要调节物质，同样也是机体免疫系统的重要能源物质和免疫分子合成底物。大量试验研究了Ile 在多种疾病模型中发挥了重要的免疫功能。在本试验中，当饲粮中Ile水平为1.01% 时，仔猪血清中IgA 水平显著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16% Ile 水 平，表 明 添加1.01% Ile可以提高断奶仔猪的免疫功能，进而促进断奶仔猪的生长发育。与本研究一致，任曼[21]研究发现，与饲粮Ile 水平为0.64%相比，饲粮Ile 水平为1.09%可显著提高断奶仔猪血液中IgA 的水平，进而增强断奶仔猪的免疫力。

3.5 饲粮异亮氨酸水平对断奶仔猪肠道微生物的影响

肠道内的微生物由细菌、真菌和原生体组成。肠道微生物具有促进肠道成熟、调节免疫、提高生长性能的作用。正常情况下，肠道微生物维持着动态平衡。其中拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是猪粪便微生物门水平中最主要四种菌群[22-23]。本研究发现，与0.78% Ile 水平相比，饲粮中Ile 水平为1.01%时，增加了断奶仔猪肠道中有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的丰度。有研究表明Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014丰度的提高，可以降低结肠炎的发生，提高肠道的健康[24]。

4 结论

在饲粮中添加不同水平的异亮氨酸对断奶仔猪的生长性能和血清生化指标无显著影响，表明异亮氨酸对断奶仔猪的生产性能无负面影响。此外，与0.87%异亮氨酸水平相比，含有1.01%异亮氨酸的饲粮显著提高断奶仔猪血清中IgA 水平，进而提高断奶仔猪的健康，这可能是由于异亮氨酸能够改变肠道微生物组成，增加了肠道有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的丰度。综合考虑，在本试验条件下，推荐在8～17 kg 断奶仔猪饲粮中异亮氨酸水平为1.01%。