大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼生长性能、体组成、血清生化指标及肠道菌群的影响

■ 向云曙 蓝汉冰 苏胜齐 朱旺明*

(1.西南大学水产学院，重庆 400700；2.广东信豚生物科技有限公司，广东广州 510630；3.广东省水产动物营养与环保高效预混合饲料工程技术研究中心，广东佛山 528211)

水产养殖规模的扩大，对于饲料原料表现出更大的需求[1]。在水产饲料组成中，蛋白原料占据着相当大的比例，是水产饲料成本的主要来源。也正是蛋白源的短缺，使得饲料成本骤然上升。为了降低饲料成本以及保障粮食安全，研究和开发新的蛋白源成为我国乃至世界亟待解决的问题。

罗非鱼，其耐低氧、抗逆性强，因此在全球范围内广泛得到养殖。因其食性特点为杂食偏植食性，所以对于植物蛋白能够很好地利用。在实际生产中，罗非鱼饲料也是以豆粕为主要蛋白原的豆粕型饲料[2]。然而，豆粕价格的逐年上涨，使得饲料成本剧增。因此，研发经济环保的蛋白质原料替代罗非鱼饲料中豆粕成为迫切的问题。

常规的酒精糟是酿酒工业产生的副产物经过干燥得到的一种产品，其产量大、价格低。由于其发酵过程中能够产生菌体代谢产物、未知生长因子等对于动物有益的因子，同时发酵也降低了抗营养因子的含量，所以在水产饲料中得到比较广泛的应用。其中，在罗非鱼[3-4]（Oreochromis niloticus）、斑点叉尾鮰[5-6]（Ictalurus punctatus）、虹鳟[7-8]（Oncorhynchus mykiss）、南美白对虾[9-10]（Litopenaeus vannamei）等水产动物上获得了良好的效果。

大米干全酒精糟来源于米酒酿造工业的副产物——米酒糟。在过去，米酒厂的湿米酒糟没有得到较好的处理，通常都是车载送给猪场饲喂和当作废弃物丢掉，不仅浪费了资源，还污染了环境。从米酒酿造使用原料和生产工艺分析，湿米酒糟可靠、安全、来源稳定，其不仅蛋白质含量高，而且蛋白质分子量小，有利于动物的消化吸收。因此，其浓缩干燥得到的大米干全酒精糟将是水产动物饲料中潜在的蛋白源。大米干全酒精糟蛋白质含量为44%～48%，脂肪含量1.5%左右，富含蛋氨酸（0.9%），缺乏赖氨酸（1.5%）。目前，大米干全酒精糟在牛[11]、鸡[12-13]等动物中已经有相关研究，然而，其在水产动物上的研究还未见相关报道。本研究通过养殖试验，探究大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼生长性能、体组成、血清生化指标和肠道菌群的影响，其重要意义在于为大米干全酒精糟的推广提供理论支撑，同时也为米酒糟找到废物再利用的途径。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

豆粕和大米干全酒精糟分别由安徽杰大饲料有限公司和广东信豚生物科技有限公司提供，必需氨基酸组成和营养水平如表1 所示。罗非鱼养殖试验饲料以鸡肉粉、豆粕、菜粕、米糠粕和DDGS 为主要蛋白源，豆油为脂肪源，面粉为糖源，同时，使用大米干全酒精糟等量替代0、20%、40%、60%、80%和100%的豆粕，配制成6 种饲料，分别标记为DRDG0(对照)、DRDG20、DRDG40、DRDG60、DRDG80、DRDG100 组。试验饲料配方及营养水平如表2 所示。原料粉碎后过80 目筛，混合均匀，之后通过膨化机制成直径为4.3 mm的颗粒饲料，烘干后喷油，密封保存。

表1 豆粕和大米干全酒精糟必需氨基酸组成和营养水平(风干基础，%)

表2 试验饲料配方及营养水平(风干基础，%)

1.2 试验鱼和饲养管理

鱼苗购回后先在暂养池（6 m×6 m×0.8 m）暂养2 周，使其适应养殖环境和膨化颗粒饲料。暂养池配备自动供氧系统，暂养期间饲喂商品饲料。暂养结束后，对吉富罗非鱼幼鱼进行称重分组，开始养殖试验。罗非鱼养殖试验于广东信豚水产研究所的循环水养殖系统的养殖桶（400 L）中进行。每桶挑选健康、状态良好、规格基本一致、总重没有显著差异的18尾吉富罗非鱼幼鱼，试验共设6个处理组，每个处理组3个重复，18个试验桶随机投喂6种试验饲料，饲养持续8周。养殖试验期间，每日2 次投喂，分别在早上（08：30）和下午（16：30）进行，投喂量为体重的3%～5%。每日根据实际摄食情况确定和调整投喂量。在投喂结束后，经过0.5 h，收集残饵置于密封袋中，储存在-20 ℃冰箱中，用于计算采食量、饲料系数。每日记录各养殖桶的死鱼数量和重量。在养殖试验期间，水温保持在17～26 ℃，水中溶氧量在5 mg/L 以上，pH 保持在7.0～8.5，氨氮维持在0.9 mg/L以下。

1.3 样本采集

养殖试验结束后，停止饲喂，饥饿24 h。在采集样品前，使用丁香酚对鱼进行麻醉，记录鱼的数量和重量，用于计算存活率、增重率和特定生长率。每个重复选择5尾鱼致死后，保存于-20 ℃冰箱中用于后续全鱼体组成分析。每个重复选择5尾鱼测定体重和体长，然后使用采血器和普通采血管对这5 尾鱼进行尾静脉采血，待血液凝固并析出血清后，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，提取上清液，混匀分装后，冷冻保存，用于后续血清生化指标的分析。将采血后的鱼进行解剖，分离内脏团并称重，用于计算脏体指数。将内脏团中的肝脏分离称重，用于计算肝体指数。

每个重复再选择6 尾鱼致死，解剖后采集肠道内容物，装于冻存管中，液氮速冻后冷冻保存，用于后续肠道菌群组成分析。

1.4 指标检测

1.4.1 生长、形体指标

养殖试验结束后对试验鱼进行称重，计算各个处理组存活率（SR）、增重率（WGR）和特定生长率（SGR）。在养殖试验过程中，每日记录投喂量，并且收集残饵。养殖试验结束后，计算采食量（FI）、饲料系数（FCR）。形体指标为脏体指数（VSI）、肝体指数（HSI）和肥满度（CF）。

存活率（SR，%）=终末鱼尾数/初始鱼尾数×100

增重率（WGR，%）=[终末鱼体重（g/尾）-初始鱼体重（g/尾）]/初始鱼体重（g/尾）×100

式中：Wf——终末鱼体重（g/尾）；

W0——初始鱼体重（g/尾）；

t——试验天数（d）。

采食量（FI，g/尾）=总投喂量（g/尾）-总残饵量（g/尾）

饲料系数（FCR）=[总投喂量（g/尾）-总残饵量（g/尾）]/鱼体增重（g/尾）

脏体指数（VSI，%）=内脏重/鱼体重×100肝体指数（HSI，%）=肝脏重/鱼体重×100肥满度（CF，g/cm3）=鱼体重（g）/[鱼体长（cm）]3×100

1.4.2 全鱼体组成分析

全鱼烘干粉碎后，检测其营养物质含量，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定[14]、粗脂肪含量采用石油醚抽提法测定[15]、水分含量采用105 ℃烘箱干燥法测定[16]、粗灰分含量采用550 ℃灼烧法测定[17]。

1.4.3 血清生化指标

使用南京建成生物工程研究所有限公司生产的试剂盒检测血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及丙二醛含量，测定方法按照试剂盒说明进行。

1.4.4 肠道菌群分析

采集的试验鱼肠道内容物样品送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，之后在美吉生物云平台进行肠道菌群组成分析，Alpha 多样性和物种丰度差异分析采用Kruskal-Wallis 秩和检验。DNA 抽提、建库、测序和分析等均由该公司完成。

1.5 数据分析

试验数据采用“平均值±标准差（mean±SD）”表示。采用SPSS 26.0 软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan’s 法进行组间多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 试验结果与分析

2.1 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼生长性能的影响

由表3 可知，各组间存活率无显著差异（P＞0.05）。随着替代比例的提高，增重率、采食量和特定生长率呈先上升后下降的趋势，饲料系数则呈相反趋势。DRDG20 组增重率、采食量和特定生长率最高，显著高于DRDG0（对照）组（P＜0.05），饲料系数最低，但与DRDG0（对照）组相比差异不显著（P＞0.05）。与DRDG0（对照）组相比，DRDG40、DRDG60 组增重率、特定生长率差异不显著（P＞0.05）。DRDG60 组采食量、饲料系数显著高于DRDG0 组（P＜0.05）。以增重率和替代水平进行曲线拟合（图1），结果显示，替代水平为24.75%时，取得最大增重率。

图1 基于增重率的二次回归曲线和方程

表3 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼生长性能的影响

2.2 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼形体指标的影响

由表4 可知，各组间脏体指数、肝体指数和肥满度无显著差异（P＞0.05）。

表4 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼形体指标的影响

2.3 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼体组成的影响

由表5 可知，对于体组成，各组粗蛋白含量无显著差异（P＞0.05）；随着替代比例的提高，粗脂肪含量呈先上升后下降的趋势。与DRDG0 组相比，DRDG60、DRDG80 组粗脂肪含量显著提高（P＜0.05）；DRDG0 组粗灰分含量低于其余各组，随着替代比例的提高，粗灰分含量总体呈现上升的趋势，与DRDG0组相比，DRDG20、DRDG60、DRDG80 组差异不显著（P＞0.05）；随着替代比例的提高，水分含量呈先降低后升高的趋势，与DRDG0 组相比，DRDG60、DRDG80组水分含量显著降低（P＜0.05）。

表5 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼体组成的影响(鲜样基础，%)

2.4 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼血清生化指标的影响

如表6所示，各组间血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、过氧化氢酶活性无显著差异（P＞0.05）。超氧化物歧化酶活性有所提高，但未达到显著水平（P＞0.05）。随着替代比例的提高，谷胱甘肽过氧化物酶活性呈逐渐升高的趋势，与DRDG0组相比，DRDG20、DRDG40组无显著差异（P＞0.05），DRDG60、DRDG80、DRDG100 组显著提高（P＜0.05）。随着替代比例的提高，血清丙二醛含量呈逐渐下降的趋势,与DRDG0组相比，DRDG100组MDA含量显著降低（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。

表6 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼血清生化指标的影响

2.5 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响

如表7 所示，各组间肠道菌群Shannon 指数、Simpson 指数 无显 著差 异(P＞0.05)。与DRDG0 组相比，试验各组Ace 指数、Chao 指数提高，但未达显著水平(P＞0.05)。

表7 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响

2.6 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼肠道菌群群落组成的影响

肠道菌群群落组成如图2 和图3 所示，各组肠道优势菌群在门水平上主要为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、厚壁菌门（Firmicutes）。优势物种丰度差异分析见图4。除变形菌门外，各菌门在各组间无显著差异。与DRDG0 组相比，DRDG20、DRDG40、DRDG60、DRDG80 组变形菌门的相对丰度显著降低（P＜0.05），放线菌门的相对丰度提高（P＞0.05）。在属水平上主要为norank_f_norank_o_PeM15、微杆菌属（Aurantimicrobium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、norank_f_JG30-KF-CM45、军团菌属（Legionella）。各菌属在各组间无显著差异（P＞0.05）。

图2 吉富罗非鱼肠道菌群群落组成(门水平)

图3 吉富罗非鱼肠道菌群群落组成(属水平)

图4 吉富罗非鱼肠道门水平和属水平优势菌群丰度差异分析

3 讨论

3.1 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼生长性能和形体指标的影响

研究表明，以大米干全酒精糟替代豆粕，未对吉富罗非鱼存活率造成显著影响。随着替代比例的提高，增重率、特定生长率和采食量呈先升高后降低的趋势，饲料系数变化趋势则相反。Azm 等[18]以玉米酒精糟及其可溶物替代饲料中菜籽粕饲喂草鱼（Ctenopharyngodon idellus），随着玉米酒精糟及其可溶物添加水平的提高，增重、特定生长率和饲料效率呈现二次曲线关系，与本研究结果相似。在一定替代范围内对生长和摄食的促进可能是因为大米干全酒精糟在生产的过程中，经过微生物的发酵，降低了纤维等抗营养因子含量，同时菌体酶系降解蛋白质为氨基酸和多肽，利于罗非鱼的消化吸收。然而，当替代比例更高时，摄食和生长出现降低，可能是因为赖氨酸含量的降低。大米干全酒精糟富含蛋氨酸，而赖氨酸含量相对较低。当替代比例逐渐提高时，赖氨酸含量降低，从而降低采食量和生长。Lay 等[19]研究也证明了这一点，其发现饲料添加赖氨酸的水平越高，罗非鱼的终末重和增重越高。与对照组（DRDG0 组）相比，DRDG80 组和DRDG100 组增重率、采食量和特定生长率显著降低，其原因可能是DRDG80 组和DRDG100 组饲料赖氨酸含量（1.29%和1.19%）低于罗非鱼需求的1.4%[19]。饲料系数由采食量和增重进行公式推导所得，其与采食量和增重紧密相关，本研究的变化趋势可能是由采食量和增重综合作用所致。大米干全酒精糟替代豆粕未对肝体指数、脏体指数和肥满度造成显著影响，与隋仲敏等[20]结果一致，该试验发现饲料添加玉米酒精糟及其可溶物替代鱼粉，未对大菱鲆（Scophthalmus maximus）脏体比、肝体比和肥满度造成显著影响。

3.2 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼体组成的影响

Diogenes 等[21]研究证实，饲料添加不同水平玉米酒精糟及其可溶物替代饲料中鱼粉不影响大菱鲆全鱼的粗蛋白含量。Suehs 等[22]以高蛋白酒精糟及其可溶物替代鱼粉和豆粕，结果显示，各组间罗非鱼全鱼粗蛋白含量无显著差异。本研究表明，大米干全酒精糟不同水平等量替代饲料中豆粕未对鱼体粗蛋白含量造成显著影响，与上述研究结果一致。然而，随着替代比例的提高，粗脂肪含量总体呈升高的趋势，这与Li等[23]研究结果相似，该试验以小麦酒精糟及其可溶物替代饲料中大豆和玉米粉混合物，发现斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）鱼体粗脂肪含量趋于增加。当大米干全酒精糟完全替代饲料中豆粕时，鱼体粗脂肪含量下降，可能是由摄入养分不足所致。水分含量的变化趋势恰好与粗脂肪相反，表明水分含量的变化可能是由粗脂肪含量变化影响所致。本研究结果显示，随着大米干全酒精糟替代豆粕比例的提高，鱼体粗灰分含量呈上升的趋势，与Li 等[24]研究结果类似，该实验表明，在400 g/kg 饲料的添加范围内，提高添加水平，尼罗罗非鱼粗灰分含量呈增加的趋势。添加酒精糟提高了鱼体粗灰分含量，原因可能是在发酵过程中植酸被分解，提高了磷的生物可利用度[25]。Omar等[26]研究也证明了这一点，其发现饲料添加150 g/kg 或300 g/kg 酒精糟及其可溶物替代鱼粉，显著提高了鲤鱼（Cyprinus carpio）对磷和镁的利用率。

3.3 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼血清生化指标的影响

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性是肝脏健康状态的重要生化指标，当肝脏受到损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶会被释放入血，导致血液ALT、AST 活性提高[27]。大米干全酒精糟替代饲料中豆粕未对吉富罗非鱼血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性造成显著影响，表明大米干全酒精糟替代豆粕对肝脏没有造成损伤。Dinani 等[12]以含不同水平（0、12.5%、15%）大米酒精糟及其可溶物的日粮饲喂肉鸡，结果显示，各组间血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性没有显著性差异，与本研究结果一致。朱战豪[28]的研究结果表明，玉米酒精糟替代不同水平（6.67%、13.33%、20%、26.67%和33.33%）的鱼粉蛋白未对珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂）血清ALT活性造成显著影响，与本研究相同。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量是机体抗氧化能力的重要标志。超氧化物歧化酶能将超氧自由基转化为过氧化氢，为过氧化氢酶提供底物，二者活性存在紧密的联系[13]。本研究表明，饲料中添加不同水平大米干全酒精糟替代豆粕对吉富罗非鱼血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性没有显著影响，但超氧化物歧化酶活性有所提高。Shirisha等[13]指出，饲料添加不同水平大米酒精糟及其可溶物显著提高了肉鸡血清超氧化物歧化酶活性，与本研究结果相似。同样，谷胱甘肽过氧化物酶活性也是衡量机体抗氧化能力的重要指标。本研究结果显示，随着大米干全酒精糟替代豆粕比例的提高，谷胱甘肽过氧化物酶活性也逐渐提高，DRDG100 组显著高于其余各组，表明大米干全酒精糟的添加提高了吉富罗非鱼的抗氧化能力。Gyan 等[29]以含不同水平酒精糟及其可溶物的饲料饲喂南美白对虾，显著提高了血清总抗氧化能力，与本研究结果相似。丙二醛是脂质过氧化的产物，其含量越高，表明脂质氧化程度越高，氧化应激越严重[30]。而大米干全酒精糟替代豆粕使得血清丙二醛含量降低，表明大米干全酒精糟减少了脂质的氧化，从而减轻了细胞膜的氧化损伤。Ray[31]的结果显示，随着DDGS 替代饲料中鱼粉蛋白水平的提高，血清丙二醛含量呈降低的趋势，与本研究相似。大米干全酒精糟对抗氧化能力的促进效应，可能是由酒精糟中存在的具有抗氧化特性的酚类化合物造成的[32]。同时，大米蛋白经过菌体酶系分解可能产生的大米肽P60 也可能是一个原因，大米肽P60 能够通过Nrf2 信号通路对体内外的氧化损伤起到保护作用[33]。

3.4 大米干全酒精糟替代饲料中豆粕对吉富罗非鱼肠道菌群的影响

肠道菌群与宿主健康息息相关，其不仅参与营养代谢，还与免疫的建立和维持有关。相较于陆生脊椎动物，水生动物肠道菌群流动性更强，对于食物成分变化高度敏感[34]，因此，研究大米干全酒精糟替代豆粕对肠道菌群的影响具有重要意义。物种Alpha多样性分析能够反映肠道菌群群落的丰富度和多样性。本研究表明，大米干全酒精糟替代豆粕对肠道菌群群落Shannon 指数、Simpson 指数、Ace 指数和Chao 指数没有显著影响，与简仕燕[35]的研究结果相似，其发现红曲米酒糟替代豆粕对山羊瘤胃微生物区系多样性（Observed species、Chao 1、Shannon、Simpson）没有造成显著影响。但Ace指数和Chao指数有所提高，表明大米干全酒精糟替代豆粕对于肠道菌群群落丰富度的提高有一定促进作用，He 等[36]也得出了类似的结论。结构平衡的菌群群落组成对于宿主肠道健康至关重要。本研究表明，在门水平上的优势菌群为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、厚壁菌门（Firmicutes），在属水平上主要为norank_f__norank_o__PeM15、微杆菌属（Aurantimicrobium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、norank_f__JG30-KF-CM45、军团菌属（Legionella），与廖庆钊等[37]、符兵等[38]对罗非鱼肠道菌群群落组成的研究结果部分相似，其差异为优势物种和丰度的不同，这是由食物组成、环境等因素差异造成的。优势物种差异分析结果表明，与DRDG0 组相比，其余各组放线菌门丰度有所提高，而放线菌门具有能够分解长链木聚糖的关键酶[39]，而木聚糖酶有利于动物对营养物质的消化吸收[40]，表明大米干全酒精糟替代豆粕对吉富罗非鱼营养物质消化吸收有一定促进作用。变形菌门是细菌中最大的类群，广泛存在于自然界、动植物，但多数为致病菌或潜在致病菌，其失调扩增通常是微生态失衡、上皮功能障碍和疾病诊断的潜在特征[41-42]。本研究结果显示，相较于DRDG0 组，其余各组变形菌门丰度显著降低，表明大米干全酒精糟替代豆粕改善了肠道菌群结构。对菌群结构的改善可能与酵母在发酵过程中产生的甘露寡糖[43]有关。杜宗君等[44]研究表明，饲料添加甘露寡糖能促进泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）肠道有益菌增殖，抑制有害菌生长，从而改善肠道微生态环境。

4 结论

在60%替代水平内，用大米干全酒精糟不同水平等量替代饲料中的豆粕能有效促进吉富罗非鱼的摄食；低水平（20%、40%）替代还能有效提高增重率，替代水平在24.75%时，取得最大增重率，60%替代对生长也不会造成不利影响；同时，大米干全酒精糟替代豆粕对全鱼粗脂肪、粗灰分和水分含量造成不同程度的影响；另外，大米干全酒精糟不同水平等量替代饲料中的豆粕能有效提高抗氧化能力，降低致病菌或潜在致病菌变形菌门的丰度。