基于CRITIC法结合响应面法优化中药复方合剂提取工艺

■ 秦淑杰 王 秀 白春苹 江国托

（大连三仪药业有限公司，辽宁大连 116036）

随着我国养牛业现代化和集约化生产程度的提 高，犊牛腹泻逐渐成为影响养牛业的主要疾病，其表现为高发病率和高病死率，是造成新生犊牛生长发育不良和死亡的主要因素之一。引起腹泻的原因主要包括感染性因素和非感染性因素，感染性因素是由细菌、寄生虫、病毒等感染引起，其中细菌感染性腹泻在犊牛腹泻中比例为10%～70%，大肠杆菌、沙门氏菌、等是主要的病原菌[1-3]。兽医在犊牛腹泻疾病中大部分使用广谱抗生素类药物进行治疗，导致耐药性非常严重，而且使用抗生素治疗腹泻的效果并不是很理想，抗生素对于病毒和环境因素造成的腹泻，使用后不但没有效果，反而使肠道正常菌群紊乱致使犊牛腹泻加重。研究表明[4]，用中药蒲公英、黄连、板蓝根等提取物能有效改善猪流行性腹泻所致的新生仔猪生长性能下降和肠道损伤，减轻腹泻。王竹青等[5]研究表明，用生地、枳壳、丹皮等中药组建复方在牛病毒性腹泻治疗中可有效提高成年牛及犊牛的治疗总有效率。单味中草药由于活性单一，药理性质差，防治效果不理想。研究发现中药复方通过协调多种药物的活性成分，提高药物对疾病的控制能力，经配伍后，能取长补短，调整宿主机体生理状态[6]。

我国中药历史悠久，源于天然，含有多种营养成分和天然化学成分，具有抑制胃肠道运动、抑菌、抗病毒和抗寄生虫作用[7-9]，是抗生素替代必不可少的开发领域。因此开发既能治疗因细菌导致的腹泻，也能治疗由病毒、寄生虫和应激刺激引起的综合性犊牛腹泻的复方中药，在反刍动物养殖业意义深远。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白头翁、马齿苋、常山和黄芪均购自大连海王星辰大药房（批号分别为200901、02920008、210613、210201；产地分别为吉林、河北、安徽宜城、甘肃）。营养琼脂、琼脂粉为北京奥博星生物技术有限责任公司提供；大肠杆菌K99购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；金黄色葡萄球菌为本实验室分离自腹泻犊牛粪便。

1.2 试验方法

1.2.1 中药复方合剂的制备

将白头翁、马齿苋、常山和黄芪60 ℃烘干，粉碎，按拟定处方比例（2∶1.5∶1∶1）准确称量，混匀。按各单因素条件水提，冰箱放置过夜，过滤后使用旋转蒸发仪浓缩至生药量1.0 g/mL。

1.2.2 抑菌能力测定

采用牛津杯法，倒入约15 mL 已灭菌的营养琼脂培养基于无菌培养皿中，凝固后37 ℃培养24 h备用。将待测致病菌菌悬液加入保温45～50 ℃的营养琼脂培养基中，吸取5 mL 于凝固备用的平板上做成菌层，使每个平板含菌量为1×107CFU。在培养皿上等距放置4 个牛津杯，分别注入200 μL 药材提取液，每个平板设一个同体积的硫酸新霉素稀释液（临床用量，原粉万分之四稀释）作为空白对照，每个因素提取液设3 个平行，于37 ℃恒温培养18 h，用游标卡尺测量并记录抑菌圈直径，计算抑菌能力A，A=提取液抑菌圈直径均值（mm）/硫酸新霉素抑菌圈直径均值（mm）[10]。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验

按拟定处方量称取药材，分别对提取温度（60、70、80、90 ℃）、提取时间（75、90、105、120 min）、液料比（25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）进行单因素试验，考察其提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径（每个单因素的四个条件提取液在同一个平板上做抑菌试验，无平板底菌浓度误差，故无需计算抑菌能力）。根据单因素试验的结果来确Box-Behnken 响应面试验的因素水平范围[11]。

1.3.2 Box-Behnken响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择拟定处方提取液对大肠杆菌的抑菌能力较高的3个单因素对应的参数作为优化中药复方合剂提取工艺的水平零点，如表1所示，分别为液料比（A）35∶1 mL/g、提取时间（B）90 min、提取温度（C）80 ℃，系统生成17个试验处理。以提取液对大肠杆菌的抑菌能力和对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为评价指标，并采用客观赋值的CRITIC 加权法计算二者的加权得分[12-13]，采用软件Design-Expert 12进行Box-Behnken响应面设计。

表1 Box-Behnken响应面法优化中药复方合剂提取的因素与水平

1.4 数据处理及分析

以上数据均重复3次，采用Excel 2010进行整理，SPSS 20软件进行数据统计分析。结果以“平均值±标准差”作图。

2 结果与分析

2.1 中药复方合剂提取条件单因素试验

2.1.1 提取温度对提取工艺的影响

将提取液料比固定为30∶1 mL/g，提取时间固定为80 min，考察提取温度分别为60、70、80、90 ℃时的提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径，结果见图1。

图1 提取温度对中草药提取液抑菌能力的影响

由图1 可知，提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径随提取温度的增加呈先升后降的趋势。抑菌圈直径在提取温度60～80 ℃呈递增趋势，80～90 ℃呈下降趋势，说明一定程度的提高提取温度有利于有效成分的释放，但达到一定温度也能破坏有效成分，而且提取温度越高，能量消耗得越多，生产成本越高。故最佳提取温度为80 ℃，此时抑菌圈直径为23.32 mm。

2.1.2 提取时间对提取工艺的影响

将提取液料比固定为30∶1 mL/g，提取温度固定为80 ℃，考察提取时间分别为75、90、105、120 min 时的提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径，结果见图2。

图2 提取时间对中草药提取液抑菌能力的影响

由图2 可知，提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径随提取时间的增加呈先升后降的趋势。抑菌圈直径在提取时间75～90 min 呈递增趋势，90～120 min 呈下降趋势，说明并非提取时间越长有效成分释放得越多，相反提取时间过长，有效成分在长时间高温状态下分解，影响其抑菌效果。故最佳提取时间为90 min，此时抑菌圈直径为24.86 mm。

2.1.3 液料比对提取工艺的影响

将提取时间固定为90 min，提取温度固定为80 ℃，考察液料比分别为25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g时的提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径，结果见图3。

图3 液料比对中草药提取液抑菌能力的影响

由图3 可知，提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径随液料比的增加呈先升后降的趋势。抑菌圈直径在液料比25∶1～35∶1 呈递增趋势，35∶1～40∶1 呈下降趋势，说明提取溶剂（水）与有效成分的释放并非正比关系[14-15]，且随着提取溶剂的增多，浓缩消耗的能量增大，生产成本提高。故最佳提取液料比为35∶1 mL/g，此时抑菌圈直径为25.67 mm。

由单因素试验可见，各因素之间存在交互作用，经过提取温度、提取时间和液料比的优化，抑菌圈直径由23.32 mm 提升至25.67 mm，因此需要进行响应面试验进一步优化。

2.2 Box-Behnken响应面法优化提取工艺

2.2.1 筛选结果

利用Design-Expert 12 软件，以综合评分（Y）为评价指标，进行Box-Behnken 响应面试验设计并提取中药复方合剂，对提取液进行大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力测定，采用在线SPSSUP 对抑菌能力数据进行无量纲化处理，选择CRITIC 权重法进行权重赋值及分权[16]，标准化数据=(该次实测值-试验最低值)/(试验最高值-试验最低值)×100[13，17]，计算综合评分Y 值。得到中药复方合剂对大肠杆菌抑菌能力和对金黄色葡萄球菌抑菌能力的权重系数分别为53.24%、46.76%。加权得分公式Y=0.532 4×大肠杆菌抑菌能力标准化数据+0.467 6×金黄色葡萄球菌抑菌能力标准化数据，结果见表2。

表2 Box-Behnken响应面法优化中药复方合剂提取工艺的试验设计与试验结果

2.2.2 回归方程的建立及显著性分析

根据BoxBehnken响应面法试验结果，利用Design-Expert12软件对表2中的数据进行二次响应面回归分析，得到二次多元回归模型方程：Y=1.38+0.026 5A+0.061 3B+0.015 3C+0.002AB-0.011AC+0.041 3BC-0.067 1A2-0.107 3B2-0.073 9C2，该模型的决定系数R2=0.950 4，说明通过二次回归得到的综合评分模型与试验模拟较好，有较好的预测性，能准确反映3 个因素对中药复方合剂提取工艺的影响。回归模型方差分析见表3。

表3 Box-Behnken响应面法优化中药复方合剂提取工艺的回归模型方差分析

由表3 可知，二次回归模型具有较好的显著性（P=0.000 9），同时失拟程度不显著（P=0.535 1），表明模型能够较好的反映液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）与提取工艺的综合评分（Y）的变化关系，该试验不存在失拟因素，所选的因素合理。根据P值大小可知，提取工艺考察的3 个因素对中药复方合剂抑菌能力的影响程度依次为B＞A＞C，其中提取时间（B）为极显著项，P值分别为0.001 2；液料比（A）、提取温度（C）为不显著项，P值0.056 5、0.230 3，显著程度A＞C；二次项中，A2、B2、C2为极显著项（P＜0.01），表明所选因素与响应值并非简单的线性关系。对液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）之间的交互作用对中药复方合剂提取工艺的影响进行响应面分析，提取时间（B）与提取温度（C）对提取工艺的影响显著（P＜0.05），液料比（A）与提取时间（B）的交互作用、液料比（A）与提取温度（C）之间的交互作用对提取工艺的影响不显著（P＞0.05）。

按所得模型绘制液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）的交互作用对中药复方合剂提取工艺影响的响应面图（图4～图6），当三维曲面图陡峭，坡度大时，说明影响有统计学意义，最高点就是交互因素的最佳条件[18]。模型预测最佳提取工艺：液料比36.416∶1，提取时间96.363 min，提取温度84.142 ℃，此条件下预测提取液对大肠杆菌的抑菌能力为1.444，对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为1.270，综合评分Y为1.363。

图4 液料比与提取时间对中药复方合剂提取工艺综合评分的响应面图和等高线图

图5 液料比与提取温度对中药复方合剂提取工艺综合评分的响应面图和等高线图

2.2.3 提取工艺优化结果及验证

为进一步确定回归方程的可预测性，通过对软件中最佳的工艺条件进行分析并结合试验生产条件的可操作性，将工艺修正为：液料比37∶1，提取时间96 min，提取温度84 ℃，按此工艺条件进行中药复方合剂提取，平行操作3 次，分别对提取液进行大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力测定，并进行标准化处理，结果见表4。实际工艺提取后中药复方合剂对大肠杆菌的抑菌能力为1.442 7，与预测值1.444 相比，相对误差为0.09%，对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为1.271 7，与预测值1.270 相比，相对误差为0.13%，综合评分Y 为1.378 0，与预测值1.363 相比，误差为1.10%（＜5%），证明利用响应面优化得到的提取工艺条件误差小，准确性好，因此该方法应用于中药复方合剂提取工艺的优化具有一定的应用意义。

表4 中药复方合剂提取工艺优化结果验证

3 讨论

体外抑菌试验是检测药物对各种致病菌的抑菌能力，是进行临床治疗的前提和基础，从侧面体现了药物的治疗效果[19]。本试验筛选的中药复方合剂，诸药合用具有清热解毒、燥湿止痢、温中散寒、益气健脾、固肠消积的功效。方中白头翁为君药，清热解毒、凉血止痢，其有效成分白头翁皂苷和香豆素类，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有很好的抑菌效果[20]。方中马齿苋为臣药，具有清热解毒、凉血消肿、抗菌抗病毒，用于治疗肠炎、热毒血痢，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及霉菌均有明显抑制作用，其水煎液可抑制病毒与细胞结合、降低病毒载量[21]。方中黄芪含有多种生物活性物质、氨基酸和微量元素，能增强机体免疫功能，提高抗病能力，并且能营卫气血、改善肠道内环境、扶正祛邪、平衡失调的菌群、清除氧自由基，使腹泻症状迅速改善[22]。方中常山具有杀虫、除痰消积的功效，能够治疗球虫病及蓿草不转。

创制新药过程中，提取工艺对中药提取效果有直接影响，进而影响疗效。提取工艺各因素与响应值之间的关系往往是交互的[23]，可以通过响应曲面的坡度和等高线的圆率来判断两因素交互作用对抑菌能力的显著程度[24]。本研究通过考察液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C），拟合最佳提取工艺建立响应面法进行工艺优化[25]。以提取液对大肠杆菌的抑菌能力和对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为评价指标，并采用客观赋值的CRITIC加权法计算二者的加权得分，计算提取工艺的综合评分（Y）。提取工艺考察的3 个因素对中药复方合剂抑菌能力的影响程度依次为B＞A＞C，其中提取时间（B）为极显著项。通过Box-Behnken 试验，得到最佳工艺：液料比37∶1，提取时间96 min，提取温度84 ℃。通过此优化工艺提取的口服液对大肠杆菌的抑菌能力为1.442 7，对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为1.276 7，综合评分Y为1.378 0。

4 结论

通过CRITIC 法结合响应面法对中药复方合剂提取工艺进行优化，可较准确地预测试验结果，并有效提高其抑菌能力，达到了优化的目的，并为中试和生产提供依据。