兽用中药玉屏风口服液质量标准提升研究

冯亚文,张秋娜,吴 兰,陈 静,张 娜,李会平,张培训,安莎莎,孔红君

(1.河北省兽药饲料工作总站,石家庄 050000;2.保定冀中生物科技有限公司,河北 保定 071000;3.保定冀中药业有限公司,河北 保定 071500; 4.河北省中兽药技术创新中心,河北 保定 071500)

玉屏风口服液源于元代《丹溪心法》,具有益气固表,提高机体免疫力的功能;主治表虚不固,易感风邪。由保定冀中药业有限公司研制生产的玉屏风口服液于2010年获得新兽药证书,至今上市已超过12年,现收录于《中华人民共和国兽药典》2020年版二部。

该制剂临床使用安全有效,但随着时代的发展,其原有的质量标准也需要进一步优化提升。查阅文献,近年来,广大学者[1-8]对玉屏风散、玉屏风口服液、玉屏风颗粒等人用药品进行深入的多指标含量测定及指纹图谱研究,多集中于黄酮-色原酮药效物质群。可见其原有质量标准收载的黄芪甲苷的含量测定过于片面,无论是药效还是物质基础都已不能满足对产品品质提升的需求。

研究中,采用高效液相色谱(HPLC)法同时对玉屏风口服液中的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行定量检测,同时优化原有质量标准中的薄层鉴别项,为全面提升玉屏风口服液的质控标准提供了依据,也实现了提升产品品质、保证疗效、提高养殖户用药认可度的目标。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药 e2695高效液相系统,2489UV检测器,Empower3色谱工作站(美国Waters公司)、CPA225D电子分析天平(德国Sartorius公司)。色谱柱:SymmetryC18(5 μm 4.6×250 mm)。

标准品:升麻素苷(批号:111522-201913,纯度为94.6%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号:111523-201811,纯度为97.4%)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号:111920-201907,纯度为96.8%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈(Merck公司,色谱纯),磷酸(天津市致远化学试剂有限公司,色谱纯),水为超纯水。

玉屏风口服液样品共计6批,保定冀中药业有限公司3批,批号为202201002、202205003、202205004;保定冀中生物科技有限公司3批,批号为202201001、202202005、202201002。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(5 μm 4.6 mm×250 mm);乙腈为流动相A,0.2%磷酸溶液为流动相B。按表1梯度洗脱;检测波长为254 nm,流速:1.0 mL/min,柱温:30 ℃;进样体积10 μL。

表1 梯度洗脱方法Tab 1 Gradient elution method

1.2.2 对照品溶液的制备 分别取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,精密称定,加50%甲醇定容至刻度,制得浓度分别为400、400、200 μg/mL的储备液。再分别精密量取各个对照品储备液,加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷20 μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10 μg的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取玉屏风口服液2 mL,置25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,摇匀,用0.22 μm滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。

1.2.4 阴性玉屏风口服液的制备 参照《中华人民共和国兽药典》2020版二部,分别制备缺黄芪和缺防风的阴性玉屏风口服液。

2 结果和分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性 通过对比玉屏风口服液样品和自行制备的阴性样品,记录色谱图,结果表明在与升麻素苷对照品(保留时间9.842 min)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(保留时间21.543 min)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(保留时间14.390 min)保留时间一致处,玉屏风口服液中均见相对应的色谱峰。同时各阴性样品在与3种对照品保留时间一致处无干扰,见图1～图4。因此,该方法的专属性良好。

图1 混合对照品高效液相色谱图Fig 1 HPLC of mixed standards

图2 玉屏风口服液高效液相色谱图Fig 2 HPLC of Yupingfeng Oral Liquid

图3 缺防风阴性样品高效液相色谱图Fig 3 HPLC of negative Fangfeng sample

图4 缺黄芪阴性样品高效液相色谱图Fig 4 HPLC of negative Huangqi sample

2.1.2 线性 精密称取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,精密称定,分别加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷381 μg、含5-O-甲基维斯阿米醇苷354 μg、含毛蕊异黄酮葡萄糖苷203 μg的对照品溶液储备液,备用。

分别取三种储备液各1 mL分别置100、50、20、10、5 mL容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,制成线性1～5的混合对照品溶液;分别取三种储备液各3 mL,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,制成线性6的混合对照品溶液,即得升麻素苷浓度为3.81、7.62、19.05、38.10、76.20、114.30,5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度为3.54、7.08、17.70、35.40、70.80、106.20,毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为2.03、4.06、10.15、20.30、40.60、60.90 μg/mL的标准曲线溶液。照1.2.1液相条件测定,并计算回归方程和相关系数,见表2。

表2 三种对照品的线性关系考察Tab 2 Linear relationship investigation of three comparasites

2.1.3 精密度 取供试品溶液,连续进样6次测定。经计算升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的峰面积RSD分别为0.94%、0.95%、0.86%,表明该方法精密度良好。

2.1.4 重复性 按1.2.3项下方法制备6份供试品溶液,测得该批产品中黄升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的平均含量分别为0.156、0.230、0.121 mg/mL,RSD分别为0.57%、0.43%、0.62%,结果表明该方法的重复性良好。

2.1.5 溶液稳定性 取2.1.4项下的同一份供试品溶液,分别于0、4、6、8、10、12、18、24 h进样测定,测得升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.77%、1.67%、1.70%,结果表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.1.6 准确度 精密量取已知含量的玉屏风口服液1 mL,置25 mL容量瓶中,加入0.156 mg/mL的升麻素苷对照品溶液,0.230 mg/mL的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液和0.121 mg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液各1 mL,加50%甲醇定容至刻度,摇匀,过滤,即得。照上述供试品方法制备6份供试品溶液,照1.2.1所述方法进行测得,计算平均加样回收率,结果见表3。3种物质的加样回收率均在96%～102%之间,相对标准偏差均小于2.0%。

表3 玉屏风口服液3种成分加样回收率试验结果(n=6)Tab 3 Recovery results of 3 compands in Yupingfeng oral liquid(n=6)

2.2 含量测定 分别取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,加50%甲醇稀释成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷20 μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10 μg的混合对照品溶液。按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,供试品溶液和对照品溶液各进10 μL,以“1.2.1”项下色谱条件检测,记录色谱图,计算含量,结果见表4。

表4 样品测定结果Tab 4 The results of the sample content

3 讨论与结论

3.1 标准来源与追溯 玉屏风口服液历次标准修订过程中,主要是对【鉴别】(1)(3)进行了修订,《兽药质量标准》2017年版中药卷删除【鉴别】(3)“采用5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品HPLC法鉴别防风”,在【鉴别】(1)增加了“采用5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品用于TLC法防风的鉴别”,并沿用至今,具体见表5。

表5 玉屏风口服液质量标准对比表Tab 5 The Comparison table of the Yupingfeng oral liquid

本研究中,注重药效物质基础的关系,拟将防风、黄芪中的有效成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行定量检测,同时用于薄层鉴别研究,进一步丰富了检测指标,提升了质量控制标准。

3.2 全面性 相比单一指标性成分(黄芪甲苷),药效组分群含量测定可更好地表达玉屏风口服液的总体功效。查阅大量文献,发现玉屏风制剂中的研究多集中在黄酮-色原酮组分群[1-3],黄酮-色原酮-内酯组分群[4-7],目标成分多见于毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、芒柄花苷、芒柄花素、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III,共计11种。

在诸多成分中,申亚君[8]等通过建立玉屏风散的HPLC指纹图谱,分别对上述11种成分进行进行聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)发现,各批次样品之间的质量差异导致15批样品聚为2类,并进一步通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得出毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷是对玉屏风散整体质量影响较大的5种成分。但是鉴于前期研究中发现毛蕊异黄酮、芒柄花素均低于0.05 mg/mL,因此本研究中仅对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷的含量测定进行研究。

3.3 与药效相关性 毛蕊异黄酮葡萄糖苷(CG)是黄芪药材中的异黄酮成分。现代药理学研究表明,CG能够明显对抗4刀豆蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖和脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞毒性,具有免疫抑制和抗炎作用[9]。姜文月等[10]采用Spearman双变量相关分析对化学成分与其增强免疫药效的谱效相关性进行分析,发现CG含量与脾脏指数呈显著正相关,是有免疫增强功能的主要药效物质。此外,CG还具有抗炎、抗肿瘤等多种药理功效。

3.4 结论 综上所述,本方法采用高效液相色谱(HPLC)法同时对玉屏风口服液中的黄芪和防风进行定量分析,经验证定量准确、快速、重复性好,为提升玉屏风口服液质量控制的全面性提供了方法。