饲粮添加芦丁对断奶仔猪回肠形态结构和屏障功能的影响

马龙飞，周斌斌，刘春雨，陈顺，王恬，王超

(南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

仔猪早期断奶易产生断奶应激[1]，常见采食量降低，肠道黏膜及屏障功能受损[2]等。研究发现断奶可导致小肠绒毛萎缩、隐窝深度增加，从而抑制营养物质的消化吸收和利用[3]。此外，仔猪断奶可引起促炎因子表达量增加，机体免疫力下降，影响肠道紧密连接功能，导致肠道黏膜通透性增加，影响机体健康[4-5]。研究发现断奶可导致肠道活性氧(ROS)增加，引起氧化应激，这可能是潜在的调控仔猪早期断奶应激的重要靶点，已受到广泛关注[6]。

芦丁是广泛存在于植物中的类黄酮物质，又名芸香苷[7]，是由黄酮苷元槲皮素和二糖芸香糖组成的糖苷，具有抗氧化、增强机体免疫等多种生物学功能，有调节断奶仔猪肠道功能的潜力[8]。研究表明，饲粮中添加500 mg/kg芦丁可改善肉鸡空肠形态结构和屏障功能[9]，提高分泌性免疫球蛋白A(sIgA)含量，降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和相应炎性因子基因表达量，增强肠道免疫，发挥抗炎作用[10]。Gautam 等[11]通发现芦丁可通过提高抗氧化酶的活性，清除自由基，保护大鼠肠道免受氧化应激的影响，增强肠道抗氧化能力。肠道功能的提高对断奶仔猪抗腹泻能力和改善饲料转化率方面起重要作用，但芦丁对断奶仔猪肠道功能的影响尚未见报道。因此，本试验通过系统研究饲粮添加芦丁对断奶仔猪肠道免疫、抗氧化和屏障功能的影响，以期为生产应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

选择16头28 d断奶，体重在(8.98±0.30)kg“杜×长×大”三元杂交公猪，随机分为2组(每组8个重复，每个重复1头猪)，对照组饲喂基础饲粮，试验(芦丁)组在基础饲粮中添加500 mg/kg芦丁，试验期14 d。基础饲粮参照美国国家研究委员会(NRC，2012)颁布的营养需求标准，相应成分和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.2 饲养管理

仔猪饲养于带有漏缝地板的不锈钢围栏中，温度为26～30 ℃，湿度为50%～60%，自由采食和饮水。定期检查猪舍环境和仔猪身体健康状况，按常规程序免疫。

1.3 样品采集与处理

饲养试验结束时，试验仔猪禁食12 h，电击屠宰取样。选取仔猪的回肠(约2.0 cm)于4%多聚甲醛溶液固定并制备切片。载玻片刮取回肠黏膜样品于冻存管，置液氮冷冻后于-80 ℃低温冰柜储存待测。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 肠组织形态观察

将回肠组织于4%多聚甲醛中固定48 h后，通过酒精、二甲苯处理，石蜡包埋、切片，再用伊红和苏木精染色后置于显微镜(尼康H5500L，东京，日本)下观察。用Image Pro Plus软件测量肠绒毛高度、绒毛宽度和隐窝深度，计算绒毛面积、绒毛高度和隐窝深度比值。

1.4.2 抗氧化酶活相关指标测定

取回肠黏膜样品(约100 mg)与生理盐水按1∶9的比例匀浆，在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，取上清液采用相应试剂盒测定丙二醛(MDA)含量，总抗氧化能力(T-AOC)，以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)的活性。试剂盒均购自南京建成生物研究所，测定步骤按照试剂盒说明书进行。使用BCA试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海，中国)测定样品蛋白浓度，指标按每mg或每g蛋白计算。

1.4.3 抗氧化、屏障功能、炎症和细胞凋亡相关基因表达量的测定

取肠道黏膜组织样品(约0.1 g)，使用TRIzol试剂(TaKaRa，大连，中国)提取总RNA，然后，使用逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)将总RNA逆转录成cDNA。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测目的基因mRNA表达，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算各基因mRNA的相对表达量，具体操作根据先前研究进行[12-13]。引物序列见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.4.4 回肠黏膜紧密连接蛋白相对表达量的测定

根据文献方法[14]测定回肠黏膜紧密连接相关蛋白表达量。试验取肠黏膜样品裂解匀浆，将等量变性蛋白进行SDS-PAGE 分离，转移至 PVDF 膜，经室温封闭，4 ℃下一抗孵育过夜，室温二抗孵育 1.5 h后，置超敏 ECL 化学发光试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)反应，再用ChemiDoc MP成像系统(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)观察并使用 ImageJ软件(Media Cybernetics Inc.，Bethesda，MD，USA)分析蛋白密度。抗体Occludin(1∶5 000)、Claudin-1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)由Proteintech Group公司提供。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 22.0软件通过独立样本t检验分析对照组和芦丁组之间的统计学差异，P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示有差异趋势。试验数据用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 芦丁对断奶仔猪回肠组织形态的影响

如图1及表3所示，与对照组相比，饲粮添加500 mg/kg芦丁对断奶仔猪回肠的绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、绒毛面积和绒毛高度/隐窝深度均无显著影响(P>0.05)。

A.对照组；B.芦丁组。

表3 芦丁对断奶仔猪回肠组织形态的影响(n=6)

2.2 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜抗氧化指标的影响

如表4所示，饲粮添加500 mg/kg芦丁显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中CAT活性(P<0.05)，并有降低MDA含量的趋势(P=0.06)，但对T-AOC、GSH和T-SOD活性无显著影响(P>0.05)。

表4 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜抗氧化指标的影响(n=8)

2.3 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜增殖与凋亡基因表达的影响

如图2所示，与对照组相比，饲粮添加500 mg/kg芦丁显著提高了回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量(P<0.05)，但对P53、CAS3、CAS9和Bax mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。

同一指标组间相比，*表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.4 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白基因和蛋白表达的影响

如图3和图4所示，与对照组相比，饲粮添加500 mg/kg芦丁显著提高了回肠黏膜中ZO-1和Occludin mRNA表达量以及Occludin的蛋白表达量(P<0.05)，但对Claudin-1 mRNA表达量和蛋白表达量均无显著影响(P>0.05)。

图3 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白基因表达的影响(n=8)

图4 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响(n=4)

2.5 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜炎症相关基因表达的影响

如图5所示，与对照组相比，饲粮添加500 mg/kg芦丁显著降低了断奶仔猪回肠黏膜TNF-α 和IL-6 mRNA表达量(P<0.05)，但对NF-κB、IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-10 mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。

图5 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜炎症相关基因表达的影响(n=8)

2.6 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜抗氧化相关基因表达的影响

如图6所示，与对照组相比，饲粮添加500 mg/kg 芦丁显著提高了回肠黏膜SOD1和SOD2 mRNA表达量(P<0.05)，但对Nrf2、Keap1、GCLC、GCLM、HO-1和GSH-Px mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。

图6 芦丁对断奶仔猪回肠黏膜抗氧化相关基因表达的影响(n=8)

3 讨论

肠道形态结构在营养物质消化吸收中发挥重要作用，仔猪早期断奶可导致肠道绒毛高度下降、肠道结构完整性受损等，影响肠道内营养物质的消化吸收[15]。在饲粮中添加生物活性物质是一种潜在的有效调控仔猪肠道健康、缓解早期断奶应激的方式。研究发现，饲粮添加番石榴叶提取物可提高断奶仔猪空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，改善肠道损伤[16]；Chen等[17]通过对断奶仔猪空肠形态结构研究还发现饲粮添加白藜芦醇可降低其隐窝深度并提高绒毛高度，维护肠道健康。但本研究结果表明，添加500 mg/kg芦丁对仔猪回肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、绒毛面积等未产生显著影响，提示饲粮添加芦丁未能显著改善回肠绒毛形态结构。而500 mg/kg芦丁显著增加了断奶仔猪回肠黏膜中Bcl-2 mRNA的表达量。Bcl-2有抗凋亡效果，是改善肠道形态结构的主要蛋白之一[18]。本试验中回肠黏膜形态结构未出现显著变化的原因可能是芦丁作用时间(试验期仅14 d)或剂量不足，后期有待进一步探讨其适宜添加剂量与时间。

肠屏障可阻止病原体透过肠黏膜组织进入机体，有效保证机体健康。细胞间的紧密连接是肠屏障功能发挥的决定因素之一[19]。ZO-1是一种紧密连接蛋白，Occludin则是一种跨膜蛋白，其蛋白表达水平降低或蛋白结构被破坏后，黏膜通透性增加，肠屏障功能下降，腹泻率增加[20]。本试验结果表明，芦丁可显著提高ZO-1和Occludin mRNA表达量，并显著提高了Occludin 蛋白表达量，提示芦丁具有改善仔猪肠屏障的作用，进而减少仔猪腹泻。本试验结果与Wang等[21]的结果相似，他们发现饲粮添加藤黄酚补充剂可显著提高肠道黏膜ZO-1和Occludin mRNA表达量和蛋白表达量，改善断奶仔猪肠屏障功能，降低仔猪腹泻。此外，添加大豆异黄酮也可增加ZO-1和Occludin mRNA表达量，缓解LPS引起的仔猪肠道屏障功能受损，缓解LPS诱导的仔猪腹泻[22]。

肠道中TNF-α和IL-6等促炎细胞因子过量表达可引起肠道炎症、损伤，严重影响畜禽健康与生长[23-25]。本试验结果表明饲粮添加500 mg/kg芦丁可显著降低断奶仔猪肠道TNF-α和IL-6 mRNA表达水平，提示芦丁具有缓解断奶仔猪肠道炎症的潜力。与本试验结果相似，Qiu等[26]也发现白藜芦醇可降低TNF-α和IL-6等促炎因子的基因表达量，缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇引起的仔猪肠道炎症。此外，研究发现TNF-α和IL-6的表达水平过高可导致肠道通透性增加、屏障功能受损[26]。本试验中饲粮添加芦丁显著降低肠黏膜中TNF-α和IL-6 mRNA表达的结果，与芦丁可显著增强仔猪黏膜屏障功能的结果一致。

仔猪早期断奶会诱导机体ROS大量产生，进而导致氧化应激，引起组织氧化损伤，甚至影响整个机体的功能[27]。研究发现，氧化应激可破坏肠道黏膜，引起肠道损伤，导致肠道屏障功能障碍，而提高肠道抗氧化可有效增强肠道屏障功能[28-29]，因此缓解氧化应激可能是改善仔猪断奶应激的重要靶点。CAT是机体主要的抗氧化酶之一，MDA是评价机体脂质过氧化的重要指标[30-31]。本试验结果表明芦丁显著提高了回肠黏膜上CAT活性，并有降低MDA含量的趋势，提示芦丁具有提高肠道抗氧化能力，缓解断奶仔猪氧化应激的效果。 SOD1和SOD2在消除过量ROS的防御系统中发挥重要作用[32]。Zhang等[33]研究发现提高仔猪肠黏膜SOD mRNA水平可有效缓解肠道氧化应激。与其结果相似，本试验发现饲粮添加芦丁显著提高了回肠黏膜SOD1与SOD2 mRNA水平，这与芦丁有降低MDA含量趋势的结果一致。研究发现氧化应激同样与细胞凋亡水平关系密切，体内大量产生的超氧阴离子、羟自由基等氧自由基可诱导细胞凋亡[34]。而SOD可通过去除超氧阴离子抑制细胞凋亡[35]。与其结果相似，本试验中芦丁在增强肠道抗氧化能力、缓解仔猪氧化应激的同时显著增加了抗凋亡基因(Bcl-2 mRNA)的表达水平。但饲粮添加芦丁对仔猪回肠黏膜中Nrf2信号通路相关基因的表达水平未产生显著影响，提示饲粮添加芦丁可能通过其他信号通路增强仔猪回肠抗氧化功能，但具体信号通路仍需要进一步探索。

4 结论

饲粮添加500 mg/kg芦丁可降低炎症反应(TNF-α和IL-6 mRNA表达水平下降)，改善断奶仔猪肠道屏障(紧密连接蛋白与基因水平表达增强)，这可能与抗氧化能力增加密切相关。此外，断奶仔猪饲粮添加500 mg/kg芦丁虽然显著增加了回肠黏膜中Bcl-2 mRNA的表达水平，但未对肠道形态结构产生明显效果。