不同质量等级酱香白酒中风味物质及差异性分析

王金龙，尹延顺，田栋伟，胡建锋，程平言*

（贵州习酒股份有限公司，贵州 遵义 564622）

酱香型白酒工艺较为复杂，因其涵盖了一至七轮次基酒的层次风格特征，呈现出酱香突出，酒体醇厚，幽雅细腻，回味悠长等风味特征而受到广大消费者的喜爱[1-3]。在酱酒利润驱使下，一些假冒伪劣事件在市场上时有发生，给酱酒行业带来不良的影响[4]。当前，大多白酒企业在酒体质量等级鉴别及出厂保障方面主要依赖感官品评[5-7]，部分企业增加了理化和色谱指标作为参考，但也仅是对酒体食品安全范畴进行把关[8]，对其他风味物质组成和香味贡献的掌握不够全面完整，造成酒样批次稳定性以及质量鉴定结果存在争议。因此，迫切需要对酒体进行全面剖析以保障企业酒体质量的合格率以及产品的稳定。

随着各种检测技术的不断发展，气相色谱法（gas chromatography，GC）[9-10]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11]、气相色谱质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-14]、电感耦合等离子质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[15]等仪器相继被应用到白酒检测分析中，目前，已有报道在白酒中检测出的风味化合物超过2 000余种，而酱香型白酒成分较其他香型更为复杂[16]。因此，在复杂的风味体系中如何找到有效的分析方法来揭示风味特征物质、筛选关键标记物及找出酒体之间的差异才是亟待解决的主要问题。

化学计量学方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析（cluster analysis，CA）与偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），因其具备了主成分分析、相关性分析及多元线性回归分析等功能[17]，近年来在白酒行业领域受到了极大的重视及应用。卓俊纳等[18]利用气相色谱-四极杆飞行时间质谱（gas chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，GC-QTOF-MS）结合化学计量学成功鉴别三种香型白酒。陈晓梅[19]利用气相色谱-嗅闻法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、GC-MS等仪器检测结果结合化学计量学对三种不同年份茅台酒香气成分进行剖析，并找出了茅台酒中35种关键香气化合物与酒体呈现的酱香、陈香、窖香、焦糖香、花香、果香和粮食香这七个感官属性之间的存在相关性。李爱兰等[20]利用吹扫捕集-气质联用结合化学计量学实现了不同产地和品牌浓香型白酒鉴别。王川南等[21]采用气相色谱技术结合主成分分析找出了6个品牌七个轮次基酒14个特征成分的含量，并探究不同轮次中特征成分的变化情况。可见，应用先进的检测工具结合专业的多元化学计量学分析方法可以实现白酒香型的鉴别、关键风味物质的寻找及轮次酒的研究。然而，该技术在企业不同质量等级白酒出厂把关和市场真假鉴别的研究方面仍较少。

本研究以同一企业5个质量等级的酱香型白酒为研究对象，借助GC、GC-MS和HPLC为检测手段，结合化学计量学方法来剖析不同质量等级酱香型白酒的风味物质组成，并结合香气活性值（ordor activity value，OAV）、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）不同等级质量等级酱香型白酒的关键差异风味物质，为白酒酒体稳定性评价、质量控制及真假酒鉴别提供科学的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同质量等级酱香型白酒样品：由遵义市某企业提供，酒精度均为53%vol，分A、B、C、D、E共5个等级，每个等级10个酒样，共50个样本，室温下密封贮存。

氯化钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）；国药集团化学试剂有限公司；乙醚、正己烷、无水乙醇（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、2-辛醇（纯度均≥99.0%）：默克化工技术（上海）有限公司；乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙缩醛、糠醛、苯甲醛、正丙醇、丁醇、异戊醇、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯等标准品（纯度均≥99.0%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

GC 8890A气相色谱仪、1260 Infinity高效液相色谱仪、GC 7890A-MS 5975C气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；QT-1旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；Eppendorf自动移液枪：德国艾本德公司；OEM型电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；Aquaplore 3S型全智能超纯水机：美国艾科浦国际有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官评价

参照国标GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》[22]与GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》[23]等相关标准，结合文献报道的方法[24-25]，选取12名有省级资格品酒人员（年龄在25～35周岁，男女比例1∶1）组成感官评价小组，在经过系统培训后，对5个质量等级的酱香酒体所包含的特征香气进行筛选，确定的特征描述词分别是“酱香”、“曲香”、“粮香”、“花香”、“果香”、“醇甜香”、“青草香”、“烘焙香”、“酸香”。

1.3.2 风味物质的测定

（1）气相色谱法

酒样的风味物质分析采用气相色谱-火焰离子化检测器（gas chromatograph-flame ionization detector，GC-FID），参照课题组前期文献报道方法[26]，具体测定指标及内标见表1，共检测风味物质45种。

表1 气相色谱法测定风味物质所用内标Table 1 Internal standards for determination of flavor components by gas chromatography

（2）高效液相色谱法

酒样的乙酸和乳酸含量测定采用HPLC法。参考赵璇等[27]报道的文献结合实验室条件，简化样品前处理。取待测酒样1 mL，通过注射针过0.22 μm有机滤膜，上机检测。HPLC色谱条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm 5 μm）；流动相：0.02 mol/LKH2PO4，pH 2.3；检测波长208 nm，柱温30 ℃，流动相流速0.8 mL/min，进样量1 μL。

（3）气相色谱-质谱联用法

酒样的微量风味物质检测参照文献报道的GC-MS法[28]，内标选用2-辛醇和2-甲氧基-3-甲基吡嗪，具体测定指标及内标见表2，共检测风味物质指标56种。

表2 气相色谱-质谱联用法测定风味物质所用内标物Table 2 Internal standards for determination flavor components by gas chromatograph-mass spectrometry

1.3.3 风味化合物定性定量

定性方法：GC-FID和HPLC采用标准品定性，GC-MS采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库检索结合标准品定性。

定量方法：GC-FID和GC-MS采用内标法，以待测物与内标物的含量比为横坐标，峰面积比为纵坐标，建立各物质的标准曲线回归方程计算各风味物质含量。HPLC采用外标法，标准品进行梯度稀释，建立各物质的标准曲线来测量各物质含量。

1.3.4 香气活性值（OAV）计算

通过香味物质的浓度（concentration，C）与阈值（odor threshold，OT）的比值计算各物质的OAV[29-30]，OAV＞1的物质对白酒香气形成有重要贡献，是关键风味化合物。其计算公式如下：

式中：C为各香气化合物质量浓度，mg/L；OT为各香气化合物阈值，μg/L。

1.3.5 数据处理

利用Excel 2019软件整理数据，Origin 2022软件制图，SIMCA 14.1软件开展判别分析及变量权重排序分析，SPSS 20.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量等级白酒的感官分析

采用感官评定的方法对5个质量等级的酱香型白酒打分，绘制感官评定雷达图，结果见图1。由图1可知，A级酒的酱香、曲香和青草香突出，粮香、花香、果香、醇甜香和烘焙香适中，酸香较淡。B级酒的酱香、曲香和烘焙香突出，粮香、花香、果香、醇甜香和青草香适中，酸香较淡。C级酒的曲香、粮香和醇甜香突出，酱香、花香、果香、青草香、烘焙香和酸香适中。D级酒的粮香和醇甜香突出，酱香、曲香、花香、果香、青草香和酸香适中，烘焙香较淡。E级酒的粮香、酸香突出，花香、果香、醇甜香和青草香适中，酱香和烘焙香较淡。结果表明，不同等级的白酒在各感官维度上存在显著差异（P＜0.05），从A级酒到E级酒中，酱香、曲香逐渐淡化，粮香和酸香逐渐突出，其差异的原因可能是老酒与新酒比例不同造成的。

图1 不同质量等级酱香白酒感官评价雷达图Fig.1 Radar map of sensory evaluation of sauce-flavor Baijiu with different quality grades

2.2 不同质量等级酒样的风味成分解析

采用GC、HPLC和GC-MS对不同质量等级的酱香型白酒的风味成分进行定性、定量分析，GC-FID，HPLC和GC-MS分析图谱以及见方法的检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、加标回收率和精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别见图2和表3。由图2和表3可知，所使用的方法基线平稳，色谱峰平滑对称，分离效果明显，且精密度及准确度良好，能满足白酒风味物质检测的要求。

图2 不同质量等级酒样的风味成分GC-FID、GC-MS和HPLC分析色谱图Fig.2 Chromatograms of flavor compounds in sauce-flavor Baijiu with different quality grades analyzed by GC-FID, GC-MS and HPLC

表3 检出限、定量限、回收率及精密度试验结果相对标准偏差Table 3 Limit of detection, limit of quantification, recovery rate and relative standard deviation of precision tests results

将不同质量等级酱香型白酒中所检出的风味物质按酸类、酯类、醇类、醛类、酮类、吡嗪类、酚类和其他类进行分类，结合各物质阈值计算其OAV，结果见表4。

表4 不同等级酱香型白酒酒样风味物质检测结果及香气活性值Table 4 Determination results and odor activity values of flavor components in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

由表4可知，通过GC、HPLC和GC-MS技术对不同质量等级酱香型白酒酒样进行定性定量分析，共检出103种风味物质，包括酸类10种，酯类34种，醇类21种，醛类9种，酮类9种，吡嗪类10种，酚类6种，其他类4种，且不同等级酒样中各种风味物质含量存在一定的差异，是酒体质量等级划分的重要依据。

酸类物质能在白酒中起到消除杂味、增加余味和促进酒体老熟等作用[30]。在几个质量等级的酱香型白酒酒体中，以乙酸和乳酸的含量上最多，远高于其他酸约2个数量级，均达到1 500 mg/L以上。在风味贡献方面，OAV＞1的有7种酸，分别是乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸，这些物质对酱香白酒酸香具有贡献。而乳酸为非挥发性有机酸，其含量虽然较高，其作用主要贡献在口味方面[31]。

酯类物质在白酒中主要以乙酯为主，占35%～45%，常常赋予酒体浓郁的果香味及饱满的酯香感[3，30]。由表4可知，酯类在酱香白酒中种类最丰富，在含量上以乙酸乙酯和乳酸乙酯含量较高，均达到1 000 mg/L以上，是酱香性白酒重要的骨架组分。从各酯类物质的OAV上分析，OAV＞1的风味物质有乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯，共13种，占所检测酯类的38%，这些物质共同形成了酒体独特的香气。特别是异戊酸乙酯和己酸乙酯，尽管酒体中含量不高，但OAV均＞100，说明其对酱香白酒香气的形成有明显贡献，在酒体中呈现“量微香大”的特点。此外，各等级酒体中也存在一定含量的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯，丰富着酒体的脂肪香气[32]。

醇类在白酒中起到助香和增甜作用，也会呈现特殊香味，如β-苯乙醇带有玫瑰花香气[30]。由于醇类物质阈值较高，在研究的白酒中OAV＞1的醇仅有6种，分别是1-辛烯-3-醇、仲丁醇、丙醇、异丁醇、丁醇、己醇，占所检测醇类的28%，大部分醇类的OAV＜1，这部分物质对酒体的贡献可能在口味上。此外，丙醇在酱香酒醇类物质中含量最高，且OAV最大，因此，推断丙醇可能是酱香酒不同与其他香型白酒的差异贡献物质。

醛酮类物质是酱香型酒体重要的一类风味物质，常常赋予酒体陈味和青草味[30]。由表3可知，醛类物质的阈值均较低，除了苯甲醛和5-甲基-2-糠醛外，78%的醛类OAV＞1，包括糠醛、苯乙醛、乙醛、丙醛、异丁醛、乙缩醛、异戊醛，说明醛类物质是酱香白酒的重要香气贡献物质，如乙缩醛（OAV＞100）赋予白酒清香柔和感[30]。酮类物质除了2-庚酮和3-羟基-2-丁酮外，其他酮类物质的OAV均＜1，其原因主要是其他酮含量太低导致。值得注意的是，3-羟基-2-丁酮（又名醋嗡）的OAV＞100，可能是酱香型白酒的关键风味物质。

吡嗪类通常赋予白酒焦香和焙烤香，在酱香型白酒中量高于其他香型，同时对其他香型具烘托叠加作用[30]。酚类在酱香型白酒中含量均低，仅愈创木酚因阈值较低造成OAV＞1，且在不同等级质量酱香型白酒中无明显差异。其他类中二甲基二硫和二甲基三硫因香气阈值较低使其OAV＞1，该类硫化物被报道是导致酱香型白酒产生盐菜味的因素[33]。此外，2-乙氧基甲烷被认为是酒体老熟的标记物[34]，在不同等级酱香酒体均能被定量到，而且存在差距，是酱香白酒关键风味成分。

本研究从103种风味物质中筛选出关键风味化合物（OAV＞1）38种，其中，酸类7种（乙酸，丙酸，异丁酸，丁酸，异戊酸，戊酸，己酸）、酯类13种（乙酸异丁酯，2-甲基丁酸乙酯，己酸丁酯，苯乙酸乙酯，苯丙酸乙酯，乙酸乙酯，丁酸乙酯，异戊酸乙酯，乙酸异戊酯，戊酸乙酯，己酸乙酯，乳酸乙酯，辛酸乙酯）、醇类6种（1-辛烯-3-醇，仲丁醇，丙醇，异丁醇，丁醇，己醇）、醛类7种（糠醛，苯乙醛，乙醛，丙醛，异丁醛，乙缩醛，异戊醛）、酮类2种（2-庚酮，3-羟基-2-丁酮）、酚类1种（愈创木酚）、硫化物2种（二甲基二硫，二甲基三硫）。

2.3 关键风味化合物热图分析

为了直观了解不同质量等级酱香型白酒酒中各物质间的种类及含量差异，利用表3中OAV＞1的38种关键风味化合物的数据，构建不同质量等级酱香型白酒中香气贡献物质热图，结果见图3。由图3可知，各香气贡献物质在酒体中含量具有较大差异，如乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯及丙醇的含量均较高，而愈创木酚、二甲基二硫和二甲基三硫含量较低。值得注意的是，因物质间最大含量与最小含量存在104个数量级的差异，通过对数条件处理后，在热图中只能直观看出各香气贡献物质间含量差异，而未能体现出不同质量等级酒之间存在的差异，达不到酒体质量等级的差异性分析要求。

图3 不同质量等级酱香型白酒样品中关键风味化合物热图Fig.3 Heat map of key flavor compounds in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

2.4 关键风味化合物的化学计量学分析

主成分分析（PCA）是一种无监督的降维多元统计分析技术，是将多个变量指标归纳为少数几个综合指标以利于分析的工具[35-36]。试验通过对50个样本中38种关键风味化合物进行PCA。结果表明，前4个主成分累计方差贡献率已到达85.30%，可代表大部分成分信息，其中，主成分1（PC1）解释了总方差的44.60%，而主成分2（PC2）解释了总方差的22.50%，共解释了数据集总方差的67.10%。由图4a可知，A级酒样坐落在第一象限，E级酒样坐落在第二象限，C级和D级酒样坐落在第三象限，B级酒样坐落在第四象限，且各等级酒能实现良好的聚集，表明不同质量等级的酱香型白酒的香气化合物的含量存在明显差异，弥补了热图分析无法区分的缺陷。

图4 不同质量等级酱香型白酒样品中关键风味化合物化学计量学分析结果Fig.4 Chemometrics analysis results of key flavor compounds in sauce-flavor Baijiu samples with different quality grades

偏最小二乘判别法分析（PLS-DA）集中了主成分、典型相关性分析和多元线性回归分析技术优点，且增加了虚拟响应矩阵，具备对数据拟合及预测的能力，可解决传统多元回归方法无法克服的问题，且在分析小样本量变量的相关性时更加可靠[28]。研究为了准确地分鉴定不同质量等级酱香型白酒之间香气组分的差异，利用PLS-DA对关键风味化合物含量进行解析。由图4b可知，PLS-DA构建的模型解释能力（R2Y）为0.968，预测能力（Q2Y）为0.961，均近于1，同样能够对五个不同质量等级的酱香型样品区分较好。由图4c可知，通过200次置换检验以评估PLS-DA模型是否过度拟合数据，置换测试的截距R2为0.059 9，Q2为-0.398 0，R2＞Q2，且Q2在负截距，表明PLS-DA模型有效。通过变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值分析可体现出各个变量对于样品分离的贡献程度，通常选择VIP值＞1的变量作为解释差异的潜在标记物质。由图4d可知，VIP值＞1的物质分别是丁醇（1.463 91）、乙醛（1.385 96）、乙酸乙酯（1.365 56）、苯乙醛（1.328 04）、丙醛（1.326 97）、丁酸（1.171 13）、丙酸（1.162 10）、戊酸乙酯（1.115 01）、2-甲基丁酸乙酯（1.109 93）、戊酸（1.093 66）、辛酸乙酯（1.090 00）、乙酸（1.088 46）、己醇（1.051 43）和异丁醛（1.048 93），共14种关键差异性香气化合物。

进一步对14种关键差异风味化合物（VIP值＞1）的含量进行分析，结果见图5。

图5 关键差异风味化合物含量分析结果Fig.5 Analysis results of key difference flavor compoundscontents

由5可知，14种关键差异风味化合物中，醇类有2种，酸类4种，酯类4种，醛类4种。以乙酸、乙酸乙酯和乙醛含量较高，在乙酸和乙醛含量对比中，A级酒中含量最多，在乙酸乙酯含量对比中，E级酒中含量最多，反观丙酸、戊酸及异丁醛等物质，尽管它们的含量较低，但同样在不同质量等级白酒之间均存在明显的差异，其原因可能是在勾调工艺中老酒、调味酒等用量不同导致的。通过对五个质量等级酒样中关键差异风味化合物（VIP值＞1）含量进行单因素方差分析，结果表明，这些关键差异风味化合物含量在不同质量等级的酱香型白酒中差异显著（P＜0.05），这一结论进一步验证了PCA和PLS-DA的分析结果。

3 结论

采用GC、HPLC和GC-MS对5个质量等级酒样进行定性、定量分析，共检出103种风味物质，通过OAV＞1筛选后，获得对酱香酒体具有香气贡献的38种关键风味化合物，借助PCA和PLS-DA建模，能实现不同等级酒样的有效区分。通过变量重要性投影（VIP）值筛选出14种关键差异风味化合物（VIP值＞1），分别为丁醇、乙醛、乙酸乙酯、苯乙醛、丙醛、丁酸、丙酸、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸、辛酸乙酯、乙酸、己醇和异丁醛，这些关键差异风味化合物含量在不同质量等级的酱香型白酒中显著差异（P＜0.05）。

本研究丰富了酒体质量评价的方法，此方法虽不能完全替代感官品评方法，但可将鉴别模型与感官分析相结合，用于不同质量酱香型白酒的鉴别，从而提供一种更高效、准确的鉴别方法，提高鉴别结果的可信度。本模型的后续研究可延伸到不同产区的酱香型白酒品质鉴定及验证，为产业高质量发展提供理论依据。