不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、血清生化指标、抗氧化能力及微量元素沉积的影响

周芷晴 吴紫倩 罗杰儿 王人开 任艳丽 周 萌 李翠金* 舒绪刚*

(1.仲恺农业工程学院动物科技学院,广州 510225;2.仲恺农业工程学院化学化工学院,广州 510225)

锌是动物正常生长发育必不可少的微量元素,不仅是300多种酶的辅助因子,也是蛋白质、核酸以及转录因子等的重要组成部分,同时还参与多种代谢过程,在动物体内具有广泛的生理生化功能。此外,锌参与抗氧化酶系统的调节,能够提高动物体内的抗氧化酶活力,具有抗氧化特性。有研究表明,鱼类长期缺乏锌或摄入锌不足会造成严重病症,导致鱼类生长性能下降、肝脏脂质累积、抗氧化能力降低及死亡率高等[1-4]现象。

氨基酸螯合锌是一种特殊的环型结构,具有良好的结构稳定性,且其可溶性强,作为机体吸收离子的主要形式以及动物体内合成蛋白质的中间物质,能够减轻矿物质之间的拮抗效应[5],同时能够减少消化过程中pH、脂类、纤维及胃酸等因素的影响,促进动物机体对锌离子的吸收利用[6]。目前,氨基酸螯合锌已经成为一种具有广泛应用前景的新型补锌剂,可用于医药产品治疗缺锌症等,亦可作为饲料添加剂用于提高动物生产性能。已有研究表明,在饲料中添加氨基酸螯合锌能够促进动物生长发育,增强其抗氧化和抗应激能力,提高免疫力和降低饲料消耗的作用[7]。此外,氨基酸螯合锌相较于无机锌具有更高的生物利用度,同时还可以增强动物机体的抗氧化能力,减少脂质的过氧化[8]。

珍珠龙胆石斑鱼是一种新杂交种石斑鱼,其肉口感软嫩有质感,而且具有快速生长和抗病能力强等特点[9],具有极大的经济价值和研究潜力。目前,氨基酸螯合锌在珍珠龙胆石斑鱼上的研究应用尚少,因此本研究通过对比饲料中添加硫酸锌、赖氨酸锌和组氨酸锌对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、血清生化指标、抗氧化能力及微量元素沉积的影响,为珍珠龙胆石斑鱼养殖过程中添加氨基酸螯合锌提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以市售饲料级七水硫酸锌(锌含量为22.42%)、赖氨酸锌(锌含量为11.23%)和组氨酸锌(锌含量为15.85%)作为锌源,其中赖氨酸锌和组氨酸锌为实验室自制(专利号:ZL202110679390.X),七水硫酸锌为市售。

1.2 试验设计与饲料

试验选取健康、规格均匀、体重[(10.00±0.05) g]相近的270尾珍珠龙胆石斑幼鱼,随机分为3组,每组3个重复,每个重复30尾。参照斜带石斑鱼[10-11]以及珍珠龙胆石斑鱼[12]对锌需要量的研究结果以及生产中的需求,无机锌组在基础饲料中添加30 mg/kg(以锌计)的硫酸锌(ZnSO4组),试验组则在基础饲料中分别添加等量的赖氨酸锌(Lys-Zn组)和组氨酸锌(His-Zn组);3组饲料中锌总含量分别为123.00、120.72和122.11 mg/kg。试验开始前,试验鱼需驯养1周。正试期56 d。基础饲料参照珍珠龙胆石斑鱼幼鱼养殖配方[13]配制,各组饲料组成及营养水平见表1。

表1 饲料组成及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

饲养试验在湛江恒兴南方海洋科技有限公司863试验基地中进行。试验开始前,分别用上述饲料预饲7 d,使其适应养殖环境及试验饲料,正试期56 d。试验期间,根据摄食情况每天表观饱食投喂2次(08:00和16:00各1次)。试验用水为经过沉淀、砂滤的天然海水,采用流动海水,控制水温为28.00～30.00 ℃,盐度为27‰～30‰,pH为7.8～8.2,水体溶解氧量≥7 mg/L,氨氮含量≤0.03 mg/L,水体锌含量为5.36 μg/L;同时,观察珍珠龙胆石斑鱼摄食情况,记录饲喂量和死亡情况。

1.4 样品收集及处理

饲养试验结束后,对试验鱼禁食24 h,用吸水纸擦干鱼体表水分,测量其总长度和重量。每组随机选取3条鱼,用剪刀从肛门口到腹部解剖鱼体,依次分离内脏团和肝脏并进行称重、记录。从每个重复中随机选取5条鱼进行取血,用1.5 mL的无菌离心管收集血液,在4 ℃下静置24 h后,在1 700×g下离心10 min,吸取上层血清保存于-80 ℃的超低温冰箱中,用于血清生化指标的测定。用无菌镊子及剪刀解剖得到的肝脏、肌肉存放于冻存管中,放置于-80 ℃超低温冰箱中保存,用于抗氧化指标和微量元素沉积的测定。

1.5 指标测定

1.5.1 生长性能

生长性能相关指标计算公式如下:

增重率(WGR,%)=[(终末均重-初始均重)/初始均重]×100;特定生长率(SGR,%/d)=[(ln终末均重-ln初始均重)/试验天数]×100;饲料系数(FCR)=摄食量/(终末总重-初始总重);蛋白质效率(PER,%)=[(终末均重-初始均重)/(摄食总量×饲料粗蛋白质含量)]×100;存活率(SR,%)=(终末尾数/初始尾数)×100;肝体比(HSI,%)=(肝脏均重/终末均重)×100;脏体比(VSI,%)=(内脏团均重/终末均重)×100;肥满度(CF,g/cm3)=(终末均重/终末体长3)×100。

1.5.2 血清生化指标和抗氧化能力

饲养试验结束后,试验鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)活性,血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)含量,血清和肝脏总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.5.3 机体微量元素沉积

将全鱼、肌肉和肝脏样品烘干,称取0.5～1.0 g样品放进坩埚中,在电磁炉上550 ℃碳化至没有白色烟雾出现,然后将坩埚转移到马弗炉中550 ℃进行灰化处理后,在坩埚中加入10 mL浓硝酸进行消化处理,接着放置在500 ℃电热板加热至液体澄清,将液体定容到容量瓶,采用电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP6000)检测铜、铁、锰和锌含量。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 25.0软件中的单因素方差分析对数据进行统计分析,并采用Duncan氏法进行组间多重比较;以P<0.05表示差异显著,结果以3个重复的“平均值±标准差”表示。

2 结 果

2.1 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响

由表2可知,饲料添加组氨酸锌对珍珠龙胆石斑鱼影响最大,其增重率达799.99%;与其他锌源组相比,His-Zn组珍珠龙胆石斑鱼终末均重、增重率、特定生长率和蛋白质效率均显著提高(P<0.05);与ZnSO4组相比,Lys-Zn组蛋白质效率显著提高(P<0.05);另外,His-Zn组饲料系数与其他组相比显著降低(P<0.05),且Lys-Zn组饲料系数相较于ZnSO4组也显著降低(P<0.05);而不同锌源对存活率、肝体比、脏体比和肥满度的影响均没有显著差异(P>0.05)。

表2 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响

2.2 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响

由表3可知,与ZnSO4组相比,Lys-Zn组和His-Zn组珍珠龙胆石斑鱼血清AST活性以及TG和T-CHO含量显著降低(P<0.05);与Lys-Zn组相比,His-Zn组血清TG和T-CHO含量显著降低(P<0.05);与其他锌源组相比,Lys-Zn组血清AKP活性显著提高(P<0.05);不同锌源对血清ALT活性以及HDL-C和LDL-C含量的影响没有显著差异(P>0.05)。

表3 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响

2.3 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响

由表4可知,与ZnSO4组和Lys-Zn组相比,His-Zn组珍珠龙胆石斑鱼血清CAT和CuZn-SOD活性显著提高(P<0.05);与ZnSO4组相比,Lys-Zn组和His-Zn组血清T-SOD活性显著提高(P<0.05),血清MDA含量显著降低(P<0.05);各组血清T-AOC无显著差异(P>0.05)。与ZnSO4组相比,Lys-Zn组和His-Zn组肝脏T-SOD和CuZn-SOD活性显著提高(P<0.05),Lys-Zn组肝脏CAT活性显著降低(P<0.05);His-Zn组肝脏CAT活性与其他锌源组无显著差异(P>0.05);另外,His-Zn组肝脏MDA含量较ZnSO4组和Lys-Zn组显著降低(P<0.05);而各组肝脏T-AOC无显著差异(P>0.05)。

表4 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响

2.4 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼微量元素沉积的影响

由表5可知,与ZnSO4组相比,Lys-Zn组和His-Zn组珍珠龙胆石斑鱼肌肉中铜含量显著提高(P<0.05),且Lys-Zn组肌肉中铜含量最高;与ZnSO4组相比,Lys-Zn组肌肉中锌含量显著提高(P<0.05),且His-Zn组肌肉中锌含量显著高于Lys-Zn组(P<0.05);与His-Zn组相比,Lys-Zn组肌肉中锰含量显著提高(P<0.05),但ZnSO4组与Lys-Zn组和His-Zn组肌肉中锰含量无显著差异(P>0.05);不同锌源对肌肉中铁含量的影响无显著差异(P>0.05)。不同锌源对肝脏中铜、铁、锰和锌含量的影响均无显著差异(P>0.05)。His-Zn组全鱼中铜含量较Lys-Zn组有所提高,但差异不显著(P>0.05);ZnSO4组全鱼中铜含量与Lys-Zn组和His-Zn组无显著差异(P>0.05);不同锌源对全鱼中铁、锰和锌含量的影响均无显著差异(P>0.05)。

表5 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼微量元素沉积的影响

3 讨 论

3.1 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响

锌是鱼类的必需微量元素,饲料中添加锌能够影响鱼类的食欲和生长性能。因此,在鱼类养殖中,不仅要注意添加锌的形式是否提高锌在鱼体内的生物利用度,还要考虑其是否能提高鱼类生长性能和维持鱼类健康的能力。本研究结果显示,饲料中添加不同来源的锌对珍珠龙胆石斑鱼的存活率、肝体比、脏体比和肥满度均无显著影响。相关研究表明,喂食不同形式的锌对鱼体成分及存活率没有显著影响。Shahpar等[14]研究了有机锌、纳米氧化锌及硫酸锌对虹鳟幼鱼存活率和鱼体成分的影响,发现不同锌源对鱼生长性能的影响没有显著差异。Yang等[15]和Mohammady等[16]研究表明,饲料中添加不同锌源对尼罗罗非鱼鱼体成分和存活率均无显著影响,这与本研究结果相似。增重率、特定生长率和蛋白质效率是反映动物机体生长和发育的重要指标,能够用于反映动物生长性能的高低,而饲料系数反映了动物的饲料利用率。在本研究中,与ZnSO4组相比,饲料添加组氨酸锌使珍珠龙胆石斑鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率均有了显著提高,饲料系数显著降低,这表明组氨酸锌较硫酸锌在珍珠龙胆石斑鱼养殖中更具有促进生长及提高饲料利用率的效果。Mohammady等[16]和Hu等[17]研究表明,有机锌或纳米氧化锌对促进尼罗罗非鱼生长性能的效果优于无机锌。Kishawy等[18]研究表明,饲喂有机锌对鱼的增重率和特定生长率有改善作用。Tan等[19]研究发现,将蛋氨酸锌作为皱纹盘鲍饲料的锌源,其生物利用度是硫酸锌的3倍。而Yang等[15]研究表明,饲料中添加苏氨酸锌显著改善了尼罗罗非鱼的增重率和特定生长率,并降低了饲料系数。通过在饲料中添加氨基酸螯合锌特别是组氨酸锌有利于提高珍珠龙胆石斑鱼生长性能,原因可能是金属离子通过共价键和离子键与氨基酸的配位体结合,使得金属元素被保护在复合物的核心中,从而以整体的方式通过肠道黏膜细胞膜、黏膜细胞和基底细胞膜进入血液[20];也可能是当金属螯合物进入消化道后,可以阻止金属元素在肠道中形成不溶性化合物,或者阻止其被吸附在不溶物上,从而使其能够直达小肠的刷状缘,并在吸收部位发生分解,其中的金属元素会以离子的形式进入到肠上皮细胞,再被吸收到血液中,因此能够使有机微量元素到达吸收部位的量比无机形态的多[21]。值得一提的是,有研究表明在石斑鱼饲料中添加赖氨酸或组氨酸能够促进其生长,并提高其饲料利用率[22-23]。而从本试验的研究结果看,生长性能的提高可能是氨基酸与锌共同促进的结果。综上可知,与无机锌相比,氨基酸螯合锌在肠道中的运输效率更高,具有较高的吸收率和生物利用率,有助于珍珠龙胆石斑鱼对营养物质的吸收,而本研究添加的2种氨基酸螯合锌中,组氨酸锌对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的效果更胜一筹。

3.2 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响

肝脏是动物机体新陈代谢器官之一,是鱼类脂代谢的主要场所[24]。鱼类肝脏中,转氨酶作为催化氨基酸和酮酸之间氨基转移的关键酶类[25],在机体新陈代谢过程中发挥重要作用,其中以ALT和AST最为重要,其活性反映了鱼体肝脏的代谢功能[26]。ALT是一种可以在应激状态下合成氨基酸以满足鱼类营养需求的酶,而AST是一种肝脏特异性酶,能促进糖异生。两者的活性变化与肝细胞损伤紧密联系,当血清中ALT和AST的活性过高时会造成一些慢性疾病和一定的死亡率[27],而活性降低可以反映出肝脏组织损伤得到改善。而AKP是动物溶酶体酶的重要组成部分,是一种单酯磷酸水解酶,直接参与磷酸基团的转移,是生物体内一种含锌的重要代谢调控酶,能够较真实地反映养殖动物锌的营养状况[28];同时,其也在免疫反应中发挥作用,其活性的增强说明机体抗应激水平得以提升,是免疫能力增强的表现之一[29]。在本研究中,与饲喂添加硫酸锌饲料的珍珠龙胆石斑鱼相比,饲喂添加氨基酸螯合锌饲料的珍珠龙胆石斑鱼血清ALT和AST活性均出现降低,血清AKP活性有所提高,且Lys-Zn组血清AKP活性显著提高。研究表明,相比于无机锌,饲喂蛋氨酸锌的白鲟鱼血清ALT和AST活性都显著降低[30];在饲料中添加有机锌能降低尼罗罗非鱼血清ALT和AST活性[31];辛小玲等[32]研究表明,在奶牛饲粮中添加氨基酸螯合锌能提高其血清AKP活性,这均与本试验研究结果相似。此外,相关研究表明,随着锌含量的增加,血清AKP活性逐渐增加[33-36],以此来增强动物机体的代谢。由此说明,氨基酸螯合锌对肝脏健康具有一定保护作用,能够提升石斑鱼的抗应激能力,并且增强其免疫能力。

肝脏是机体进行脂质代谢的主要场所,机体其他组织对脂肪的利用均需经过肝脏代谢和血液循环运输而获得,因此,检测血清中脂类代谢标志物含量能反映机体对脂质的代谢情况[37]。TG和T-CHO是鱼类肝脏脂质代谢的重要指标,并且两者在体内的变化情况是趋于一致的。HDL-C和LDL-C是胆固醇代谢的产物,饲喂不同形态的锌对机体脂质代谢具有重要影响[38]。有研究表明,与无机锌相比,饲喂蛋氨酸锌的蛋鸡血清TG、T-CHO和LDL-C含量显著降低,而血清HDL-C含量无显著变化[39]。张芸菡[40]研究表明,与硫酸锌相比,甘氨酸锌能够显著降低肉鸭血清TG含量。本研究结果显示,与饲喂添加硫酸锌饲料的珍珠龙胆石斑鱼相比,饲喂氨基酸螯合锌饲料的珍珠龙胆石斑鱼血清TG和T-CHO含量显著降低,但不同锌源对血清HDL-C和LDL-C含量没有显著影响。其原因可能是氨基酸螯合锌由于结构更加稳定,使锌被小肠吸收的含量更高,从而被肝脏吸收利用发挥作用效果更强,故使得血清中TG含量降低[41]。另外,氨基酸螯合锌中的配体氨基酸也可能起到降低血清TG含量的作用,饲料中适当添加赖氨酸可促进生长,增加肉碱含量,降低组织中TG含量[42];组氨酸则能通过抑制合成TG相关酶的活性,从而降低血清TG含量[43]。

3.3 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响

抗氧化系统对于动物来说是重要的保护防御系统,可以阻止组织细胞受到游离基、活性氧等的侵害,同时动物体的抗氧化酶在活性氧的清除以及机体的保护作用中也起着至关重要的作用。而锌具有一定抗氧化特性,能起到抗炎和抗氧化作用,可以通过占据脂质、蛋白质和DNA的铁或铜结合位点而发挥直接的抗氧化作用[44]。锌还是维持正常肝脏功能所必需的,能降低因氧化或炎性导致的肝脏损伤[40]。T-AOC是能够反映动物机体抗氧化能力的综合参数。超氧化物歧化酶是能清除超氧阴离子自由基的抗氧化金属酶,它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢,是动物机体抗氧化防御系统的第一道防线,能够防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能,保护细胞免受氧化损伤[45]。CuZn-SOD是超氧化物歧化酶中具有抗氧化作用的一种重要含锌酶,锌的长期抗氧化作用包括维持CuZn-SOD的稳定[46]。CAT是含巯基抗氧化酶,它能与体内的过氧化氢进行特异性地结合,将其分解成氧和水,保持体内的氧化还原平衡,从而维持内环境稳定以及细胞功能正常,使动物机体免受氧化应激的损伤。而MDA含量在一定程度上能够说明机体内脂质过氧化水平,以此来表现出细胞或机体受损伤的程度。在本研究中,与饲料中添加硫酸锌相比,饲料中添加氨基酸螯合锌提高了珍珠龙胆石斑鱼肝脏T-SOD和CuZn-SOD活性,且Lys-Zn组肝脏CAT活性显著提高,His-Zn组肝脏MDA含量显著降低。相关研究表明,饲料中添加不同形态的锌对珍珠龙胆石斑幼鱼[12]、奥尼罗非鱼[47]、黄颡鱼幼鱼[48]机体SOD活性均有一定程度的提高,并且能显著降低MDA含量。在以往的研究中发现,有机锌的抗氧化作用要强于无机锌,与硫酸锌和氧化锌相比,饲粮中添加甘氨酸锌能够提高断奶仔猪肝脏CuZn-SOD活性[49-50];蛋氨酸锌和纳米氧化锌相比于氧化锌能够提高CAT和超氧化物歧化酶活性,降低MDA含量[51];相较于硫酸锌,随着羟基蛋氨酸锌添加水平的提高,蛋鸡肝脏T-AOC和超氧化物歧化酶活性显著提高[52],对蛋鸡抗氧化性能产生积极影响;在Tunçdemir等[53]的研究中,糖尿病小鼠肝脏MDA含量可以作为肝脏氧化损伤的标志,经锌处理后糖尿病小鼠肝脏MDA含量显著降低。锌的添加可以提高金属硫蛋白(MT)基因的表达,而MT能清除氧自由基,降低MDA的产生,从而增强机体的抗氧化能力[54]。此外,本试验中,珍珠龙胆石斑鱼血清中抗氧化指标的结果与肝脏中结果类似,由此可知,氨基酸螯合锌具有比无机锌更强的抗氧化活性。

3.4 不同锌源对珍珠龙胆石斑鱼微量元素沉积的影响

微量元素在动物机体的生长发育中发挥重要作用,是机体新陈代谢过程中必不可少的养分[55]。微量元素之间存在相互协同和拮抗关系,直接影响了微量元素的吸收乃至整个营养成分的代谢与利用[55]。而通过测定鱼体、肌肉和肝脏中的微量元素沉积量可以有效地判断鱼机体对矿物质的利用情况,有助于评估鱼类的营养价值和质量安全[56]。本研究结果显示,与在饲料中添加硫酸锌相比,在饲料中添加氨基酸螯合锌显著提高了珍珠龙胆石斑鱼肌肉中铜和锌含量,并且His-Zn组肌肉中锌含量显著高于Lys-Zn组,而Lys-Zn组肌肉中锰含量要比His-Zn组更高。另外,His-Zn组全鱼中锌含量较Lys-Zn组有所提高。结果表明,氨基酸螯合锌对珍珠龙胆石斑鱼的健康及微量元素沉积有积极作用。理论上讲,氨基酸螯合物是一种金属离子与氨基酸分子通过配位键结合形成的螯合物,具有良好的结构稳定性和较高的吸收效率,可以减轻机体内矿物质的拮抗作用,从而使机体更好地吸收金属离子[57],因此出现组织铜元素沉积量提升的结果可能是因为摄入有机锌后减少了与胃肠道中其他元素的相互作用[58],另一种可能性是肠道对铜的吸收能力提高。而本试验中,各组肝脏中微量元素沉积没有显著差异,这也与大西洋鲑饲喂不同水平锌的养殖试验具有相似的结果[59]。肝脏组织中的锌以MT为主,且含量比较稳定[60-61],因此本研究中肝脏中稳定的锌含量可能代表了一种正常的内稳态机制。综上所述,氨基酸螯合锌在一定程度上是能够促进珍珠龙胆石斑鱼肌肉和全鱼中的微量元素沉积。

4 结 论

氨基酸螯合锌作为锌饲料添加剂应用于珍珠龙胆石斑鱼的养殖中,对改善石斑鱼生长性能、机体脂质代谢、抗氧化能力和微量元素沉积具有积极作用,并且与硫酸锌相比效果更好。而2种氨基酸螯合锌源中,组氨酸锌较赖氨酸锌对珍珠龙胆石斑鱼的应用效果更好。