番鸭不同质地蛋壳超微结构及其与蛋壳强度的关联分析

梅慧灵 郑定黔 赵邦哲 田若宁 陈 莹 李 昂 连森阳 梅景良 吴 旭

(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州 350002)

蛋壳是家禽产生的一种生物矿化壳,是蛋体与外界接触的最外围结构,由内而外依次为:壳膜层、乳突层、栅栏层、晶体层和角质层5个部分[1-5]。当前,由于养殖方式的改变尤其是现代集约化封闭式舍饲或笼养的出现,破壳蛋、软壳蛋、沙壳蛋(也称砂壳蛋)以及裂纹蛋等大幅增加,致使蛋壳不能完全发挥其应有的作用,严重影响禽蛋品质乃至养禽业的健康发展[6]。因此,研究蛋壳品质的改善问题具有非常重要的经济价值和生物学意义。

长期以来,改善蛋壳品质的研究主要是聚焦于饲养环境、营养供给控制、蛋壳品质调控候选基因以及蛋壳沉积形成机制差异等诸多方面[7-11],与此同时,蛋壳超微结构的相关研究也已逐渐成为热点。目前,关于蛋壳超微结构及组成的研究主要集中在鸡蛋方面[5-7,12],在鸭蛋方面的研究报道仍较少[13-14]。

番鸭原产于热带地区,因其喜温的特性,使其成为我国南方饲养比较多的水禽品种,然而有关其蛋壳的相关研究报道却极少。李昂等[15]以白番鸭为研究对象,探究了其所产鸭蛋蛋壳气孔数以及壳厚对出雏效果的影响;连森阳等[16]比较了白番鸭沙壳蛋与白壳蛋、青壳蛋蛋壳性状对孵化效果的影响。条纹蛋(亦称螺纹蛋)在番鸭蛋中也是颇为常见的一种蛋壳结构异常蛋,其孵化率(64.3%)显著低于正常蛋(88.5%)[17]。目前国内外未见有番鸭正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳在超微结构性状上的比较研究报道,蛋壳超微结构性状与蛋壳强度(eggshell strengh,ESS)之间的关联性如何亦属未知。

因此,本试验以白羽番鸭为研究对象,通过观察比较白色的正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳的超微结构,并分析蛋壳超微结构性状与蛋壳强度之间的关联性,以期为番鸭不同质地蛋壳的结构和力学特性研究,以及为今后选育和改良提高番鸭蛋蛋壳质量研究积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用白壳蛋产自福建省莆田秀屿番鸭育种场300日龄MB品系白羽番鸭。该番鸭为笼养,按常规方法管理,饲养条件相同。产蛋当天随机采集白色的正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋各200枚,其中:长径为61.5～63.5 mm、宽径为45.5～46.5 mm,在照蛋器光照下能显示颜色均匀、无沙质点和条纹的鸭蛋即为正常蛋;沙质点分布面积大于蛋壳表面40%的为沙壳蛋;整个蛋壳分布有多条明暗相间螺旋条纹的为条纹蛋。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋壳质量常规测定

将鸭蛋运回实验室后,除去蛋表面的脏污,对完好无损的3种蛋分别加以编号。用电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]对每枚蛋进行称重;用速读式游标卡尺(东菀三量量具有限公司)测量蛋的长径和宽径,计算蛋形指数(egg shape index,ESI);用蛋壳强度测定仪(EFG-0503,日本Robotmation公司)测定蛋壳强度。然后将每枚蛋分为两半,除去蛋中内容物(包括壳膜),冲洗干净后收集蛋壳,置于5%乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)溶液中浸泡20 min,用刷子除去蛋壳外表层的角质层后即为钙化壳,置烘箱于45 ℃下烘干,再对每枚蛋的钙化壳进行称重,即得钙化壳重(calcified shell weight,CSW)。将钙化壳依蛋壳长径方向分成5个部位,依次为大顶、大区、赤道、小区和小顶,用螺旋测微器(东菀三量量具有限公司)测量每个部位的厚度,5个部位厚度的平均值即为该枚蛋壳的钙化壳厚度(calcified shell thickness,CST)。最后,将这些蛋壳置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 蛋壳超微结构观测

在1.2.1蛋壳质量常规测定的基础上,选取钙化壳厚度相近的正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳各12枚,分别作为3种不同质地蛋壳的试验组,每组设12个重复,每个重复1枚蛋壳。将这3组蛋壳从-70 ℃冰箱中取出,随后用酒精进行浸泡和去污处理,再使用无水乙醇清洗后晾干,保存备用。

3组蛋壳分别逐个取其赤道部各一块(1 cm×1 cm)作为样品,并做好标注。将每个蛋壳样品分成小碎块,各取3个小块作为每个蛋壳的测试材料。将每一小块蛋壳按外表面、内表面和横断面的顺序黏于观测台上,喷金。使用S3400N型扫描电镜观察蛋壳各个区域的超微结构,拍照。

测定乳突层厚度(mastoid layer thickness,MLT)和乳突间隙(mastoid gap,MG)。乳突层厚度为相邻乳突底部交界处最低点到乳突结节顶点的距离,乳突间隙为2个相邻乳突结节顶点之间的距离。各测量3个不同位置的乳突层厚度和乳突间隙,各取其平均值。计算有效厚度(effective thickness,ET),这里的有效厚度是指不包括乳突层的钙化壳厚度。

在放大100倍显微镜下测定视野内蛋壳乳突大小。平均乳突大小(average mastoid size,AMS)以乳突锥体基底部直径或宽度S表示,计算公式为:

S=L/N。

式中:L为视野内一排乳突锥体的总宽度;N为乳突锥体的个数。

1.3 数据统计与分析

应用Excel 2016对试验数据进行初步处理;运用统计分析软件SPSS 20.0对数据进行统计分析。其中,用Z分数检验剔除差异过大的数据(Z分数大于3或小于-3的数据为需要剔除的数据),用单因素方差分析(one-way ANOVA)统计3组蛋壳之间蛋壳品质指标的差异,用双变量相关分析统计各个蛋壳品质指标之间的相关性,结果以“平均值±标准差”表示,以P<0.05为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 3种不同质地蛋壳质量性状的比较

对3种蛋壳的质量性状指标进行统计,结果见表1。蛋壳强度在3种蛋之间差异显著(P<0.05),表现为正常蛋>沙壳蛋>条纹蛋;蛋形指数、钙化壳厚度和钙化壳重在3组间差异均不显著(P>0.05)。

表1 蛋壳质量性状测定结果

对3种蛋壳的质量性状指标进行了相关性分析,结果见表2。3种蛋的蛋形指数、钙化壳厚度及钙化壳重与蛋壳强度之间的相关性均不显著(P>0.05)。

表2 蛋壳质量性状相关性分析结果

2.2 3种蛋壳的超微结构

2.2.1 蛋壳外表面和内表面的超微结构

如图1所示,正常蛋蛋壳外表面皲裂较少,裂纹较浅,显得比较平整;分布的气孔数量少,直径小而浅(图1-A);沙壳蛋蛋壳外表面皲裂略多,深度略深,局部裂纹已连成网状,表观显得不平整;分布的气孔较多,直径大且深(图1-B);条纹蛋蛋壳外表面皲裂密集且较深,裂纹间连通形成的网络较明显,表观凹凸不平;分布的气孔较少且较小(图1-C)。此外,条纹蛋蛋壳外表面分布有众多大小不等的颗粒状突起,正常蛋和沙壳蛋蛋壳较少见。

A、B和C分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳外表面;D、E和F分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳内表面;G、H和I分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳横断面。

正常蛋蛋壳内表面纤维密集,主次分支清晰,纤维按层次呈直线状纵横交错,且同一层次的纤维方向比较一致有序,整体纤维网结构平面感较强(图1-D);沙壳蛋蛋壳内表面纤维疏松凌乱,主次分支不清晰,结构层次性不佳,纤维间空隙较多,可见众多乳突的顶端侵入纤维层中形成乳突结节(图1-E);条纹蛋蛋壳内表面纤维分布较沙壳蛋更为稀少,走向也杂乱无序,主次分支不明,纤维间有明显间隙,可见到每个乳突的乳突结节,甚至可观察到纤维层下部分乳突顶部的样貌(图1-F)。

2.2.2 蛋壳横断面的超微结构

正常蛋蛋壳横断面较平整,整体结构致密,乳突锥体小且突出,乳突单元排列紧密,大小均一,乳突层与壳膜内层连接较紧密(图1-G);沙壳蛋蛋壳横断面凹凸不平,其乳突锥体较大,各乳突单元排列不甚整齐,有个别畸形乳突单元存在于正常乳突单元之间,使得乳突间缝隙加大(图1-H);条纹蛋蛋壳横断面平整性极差,乳突锥体大小不均,各乳突单元排列不整齐,乳突层厚度占蛋壳横断面整体的比例比正常蛋、沙壳蛋的大(图1-I)。此外,沙壳蛋和条纹蛋蛋壳的乳突层与壳膜内层连接均不紧密。正常蛋蛋壳乳突锥体之间排列整齐性最好,乳突间隙较小,乳突锥体大小较为均一,乳突层厚度较小(图1-G);沙壳蛋蛋壳乳突锥体大小相对于正常蛋而言,明显瘦小,乳突间缝隙有所增大,乳突锥体排列开始出现疏松现象,乳突层厚度有所增加(图1-H);条纹蛋蛋壳乳突锥体排列十分疏松,乳突间的缝隙明显扩大,各乳突锥体变得细长,乳突层更厚(图1-I)。

如图2所示,钙化壳的最外层是晶体层,3种蛋壳晶体层的晶体排布均较为杂乱。正常蛋蛋壳的晶体层较平整,大部分晶体生长方向与蛋壳表面垂直,晶体排列紧密,晶格棱角分明(图2-A);沙壳蛋蛋壳的晶体层平整性略差,仅少部分晶体生长方向与蛋壳表面垂直,晶格棱角不分明(图2-B);条纹蛋蛋壳的晶体层排列疏松,大量小块晶体堆积分布,与栅栏层之间连接不紧密(图2-C)。

A、B和C分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳晶体层;D、E和F分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳栅栏层;G、H和I分别表示正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳乳突层顶部。

晶体层之下是栅栏层,3种蛋壳的栅栏层均呈明显的波浪形起伏。进一步放大倍数观察,可见正常蛋蛋壳栅栏层的块状晶体具有3种亚超微结构形式:一种是与蛋壳表面平行的多层板状结构,每层小板晶体致密平滑,厚度约50 nm,层间结合紧密,由许多小板晶体单元相互层叠在一起构成一个大晶体,大晶体间有少量气孔洞,这种晶体结构较为多见;另一种是块状晶体结构,其上存在多种方解石解理,许多块状晶体单元相互连接在一起构成一个大的单晶,大晶体间分布有少量气孔洞,这种晶体结构也较常见;再一种是无定形晶体,呈颗粒状,许多颗粒状晶体单元也可构成一个大的单晶,这种晶体结构较少见(图2-D)。沙壳蛋蛋壳栅栏层的多层板状结构不明显,小晶体呈不定形结构,可见不平行的层叠状纹理,由小晶体构成的大晶体排列不规则,断面不整齐,大晶体间可见较多气孔洞(图2-E)。条纹蛋蛋壳的栅栏层基本上也是由多层平行的小板晶体单元组成,晶面呈多方向排列,且夹杂较多非板状结构晶体;小板晶体较易破碎,断面不整齐,层叠状的大单晶较少见,气孔洞较多(图2-F)。

正常蛋蛋壳乳突层顶部质地致密,与纤维层连接较好,乳突锥体上有少量小的气孔洞(图2-G);沙壳蛋蛋壳乳突层顶部由颗粒状霰石构成,结构致密性较差,与纤维层连接不紧密,乳突锥体上有较多大小不一的气孔洞(图2-H);条纹蛋蛋壳乳突层顶部和周边组织结构松散,整体致密性差,与纤维层的连接不够紧密,连接部有大量方块状霰石散布,乳突锥体上有许多小的气孔洞(图2-I)。

通过对3种蛋壳超微结构的量化统计分析可知(表3),3种蛋壳钙化壳厚度和平均乳突大小均无显著差异(P>0.05);沙壳蛋和条纹蛋蛋壳乳突间隙均显著高于正常蛋蛋壳(P<0.05),但沙壳蛋和条纹蛋蛋壳之间差异不显著(P>0.05);在乳突层厚度和有效厚度的性状上,各组之间均存在显著差异(P<0.05)。

表3 3种蛋壳超微结构的比较

2.3 蛋壳超微结构性状相关性分析

蛋壳超微结构性状相关性分析结果见表4。3种蛋壳的有效厚度与蛋壳强度均呈显著正相关(P<0.05),其相关系数分别为0.693、0.743和0.657,这表明有效厚度在一定程度上影响蛋壳强度;3种蛋壳的乳突层厚度与蛋壳强度均呈显著负相关(P<0.05),其相关系数分别为-0.868、-0.856和-0.837,这表明蛋壳的乳突层厚度与蛋壳强度的关系更为紧密,乳突层厚度越小,其蛋壳强度就越大;3种蛋壳的乳突间隙与蛋壳强度也均呈显著负相关(P<0.05),其相关系数分别为-0.736、-0.764和-0.781,这表明乳突间隙在很大程度上与蛋壳强度相关联,乳突间隙越大,其蛋壳强度就越小;3种蛋壳的钙化壳厚度和平均乳突大小与蛋壳强度的相关性均不显著(P>0.05)。

表4 蛋壳超微结构性状相关性分析结果

3 讨 论

3.1 蛋壳强度与蛋壳品质的关系

禽类的蛋壳是一种矿化壳,因其具有高度的密闭性、隔绝性和抗压性,成为禽蛋的天然保护壳,能保护其内容物不受到破坏,尤其是有效限制了微生物对其内容物的污染,使禽蛋可以较长时间保存;另外,其具有的多孔性也有利于卵生禽类胚胎在体外发育时可以顺利进行气体交换和水分蒸发[1,18]。蛋壳的质量性状主要包括蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳韧度、蛋壳厚度、蛋壳比例、蛋比重及蛋壳颜色等,这些性状基本上构成了蛋壳的结构属性,共同影响着蛋壳品质[7]。随着研究的不断深入,研究者逐渐将目光聚焦到蛋壳强度与蛋壳品质的相互关系上,并认为蛋壳强度是影响蛋壳品质的主要因素[6,8,19]。因此,研究者将研究重心转向了蛋壳强度的影响因素上,并发现蛋壳强度是取决于蛋壳物质变量和结构变量的一个综合属性。结构变量包括蛋壳的厚度、蛋壳表面物质的分布以及蛋的大小和形状等因素,这些因素对蛋壳强度有一定影响[8],如章世元等[7]发现蛋壳强度是与蛋壳的结构属性不同相关联的,但邹剑敏等[20]认为蛋壳强度变化与蛋壳厚度的变化无关。因此,为了排除厚度这一不确定因素的干扰,本试验选取了番鸭厚度相似的3种不同质地蛋壳来进行相关研究。

对蛋壳质量性状进行研究的结果表明,厚度相似的这些番鸭蛋蛋壳其蛋壳强度在正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋三者间差异显著,而蛋形指数、钙化壳厚度和钙化壳重在三者间差异均不显著。由此可见,对于厚度相似的蛋壳,不同质地会显著影响到蛋壳强度,但对蛋形指数和钙化壳重的影响并不显著。同时,本研究还发现厚度相似的蛋壳其蛋形指数和钙化壳重与蛋壳强度的相关性均不显著,这说明在钙化壳厚度相似的情况下,与蛋壳强度变化密切相关的不是蛋形指数和钙化壳重,而是蛋壳的其他结构属性。目前,大多数研究者认为蛋壳的超微结构对蛋壳强度具有重大影响,并进行了广泛而深入的研究[6,7,21]。因此,为了探究番鸭蛋蛋壳质地对蛋壳强度的影响机理,本文在超微结构水平上对其展开了初步研究。

3.2 蛋壳超微结构对蛋壳强度的影响

蛋壳的结构由内至外一般有5层,但在本研究中通过扫描电镜观察到,3种质地的番鸭蛋蛋壳其超微结构均为4层,由内而外依次为壳膜层、乳突层、栅栏层和晶体层。这里的壳膜层应是壳膜内层。通常情况下,壳膜有2层,即壳膜外层和壳膜内层。由于壳膜内层与乳突结节紧密嵌合在一起较难剥离,因此在处理样品制作钙化壳时被剥离的壳膜是壳膜外层,而在扫描电镜下观察到的蛋壳内表面纤维组织是属于壳膜内层的结构。本研究中未明显观察到晶体层之外的角质层,因其在样品清洗处理时已基本被去除。因此,本研究中观察到的蛋壳横断面的4层结构与其他禽类蛋壳的相应层次构成是一致的[1,6,7,19,22]。然而,番鸭蛋蛋壳在不同层次上的超微结构特点于3种蛋之间是存在差异的,沙壳蛋和条纹蛋蛋壳的外表面不平整,皲裂较正常蛋蛋壳多且深,气孔也较多,在条纹蛋蛋壳外表面尚分布有更多大小不等的颗粒状突起;沙壳蛋壳膜内层纤维较疏松凌乱,纤维间空隙较多,条纹蛋壳膜内层纤维分布较沙壳蛋更为稀少,纤维间有明显间隙;沙壳蛋和条纹蛋蛋壳的横断面(栅栏层和晶体层占大部分)的平整性及致密度都更差,乳突锥体较小,乳突单元排列不紧密不整齐且大小不均,乳突层与壳膜层联系也更加不紧密。番鸭3种蛋壳在超微结构上存在的这种差异,应该是这3种蛋壳在结构属性上表现出不同质地的内在原因。

本研究也观察到3种蛋蛋壳强度的高低与蛋壳在超微结构方面的特点是相一致的,且与现有的大部分研究报道[23-25]相符合。为进一步探讨蛋壳超微结构与蛋壳强度之间的关系,以及不同层次超微结构对蛋壳强度的影响程度,本文尚对3种蛋壳的超微结构性状与蛋壳强度进行了相关性分析,结果发现三者的乳突层厚度、乳突间隙及有效厚度与蛋壳强度均存在相关性,其中乳突层厚度和乳突间隙与蛋壳强度均呈显著负相关,有效厚度与蛋壳强度呈显著正相关,说明在超微结构层面上乳突层厚度、乳突间隙及有效厚度的变化与蛋壳强度的增减高度相关。在3组相关系数中,乳突层厚度与蛋壳强度间的这组数据的绝对值最接近1,说明蛋壳的乳突层厚度与蛋壳强度的关系更为紧密,乳突间隙次之。从3种蛋壳超微结构层次上的变化也可发现,随着正常蛋、沙壳蛋和条纹蛋蛋壳的乳突层厚度依次显著增厚,乳突间隙逐渐变大,3种蛋的蛋壳强度显著递减。蛋壳厚度相似的番鸭蛋蛋壳强度与超微结构间的这种变化规律,与章世元等[7]的研究结果也是相一致的。

关于不同层次超微结构中哪一层是对蛋壳强度起主要决定作用,目前研究者的观点并不统一,有的认为是栅栏层[18,26],有的认为是乳突层[27],而Bain[8]则发现乳突层对蛋壳的硬度特性没有起贡献作用,并得到Carnarius等[28]的研究证实。因此,Bain[8]后来提出了有效厚度(即从栅栏柱融合点到角质层外缘的距离)这一概念,认为有效厚度才是评价蛋壳强度的最合适指标。有效厚度的概念已为研究者所接受和应用[18,29],但国内也有学者将有效厚度称为有效层厚度[30],因此这里暂且将有效厚度所包含的栅栏层与角质层之间的诸层一起统称为有效层。大量的相关研究结果已表明,蛋壳中的有效层是蛋壳钙化的主要部分,也是与蛋壳强度关系最密切的部分。因而实际上,有效厚度是剔除乳突层后的钙化壳厚度。本研究亦发现,有效厚度与番鸭的蛋壳强度呈显著正相关。有学者认为,有效层的内在强度主要是取决于乳突层的稳定性以及方解石柱状结构交叉的程度和碳酸钙的密度[28]。因此总的来说,在超微结构层面上,乳突层厚度、乳突间隙和有效厚度共同对蛋壳强度产生重大影响。

4 结 论

① 厚度相似的3种番鸭蛋蛋壳其蛋壳强度存在显著差异,超微结构也存在显著差异,其中乳突层厚度和乳突间隙与蛋壳强度均呈显著负相关,有效厚度与蛋壳强度呈显著正相关。

② 在蛋壳的超微结构层面上,乳突层厚度、乳突间隙及有效厚度是影响蛋壳强度的主要因素。