益母草碱调节Fas/FasL信号通路对乳腺癌细胞恶性生物行为的影响

宋梦 许承彬 张来香 宋炜

乳腺癌发生于乳腺上皮组织细胞,其发病率居女性恶性肿瘤发病率首位,严重危害女性生命健康[1]。目前,乳腺癌的治疗以手术切除为主,再根据病情以放疗、化疗等为辅助治疗,放疗费用高、不良反应大,现阶段,化学药物治疗仍为主要的临床治疗手段[2]。由于乳腺癌易复发、易转移,筛选高效、低毒的治疗药物对乳腺癌的治疗具有重要的临床意义。益母草碱是从益母草中提取的一种天然生物碱,具有多种药理活性,如抗氧化、神经保护、抗癌、抗炎等[3],已被用于抗癌药物的研究中。Lin等[4]研究表明,益母草可以显著促进人宫颈癌细胞的凋亡。Liu等[5]研究表明,益母草碱可以通过抑制的miR-18a-5p/SOCS5/JAK2/STAT3轴活性,破坏CML恶性肿瘤。且益母草碱在动物的毒性实验中尚未出现明显的不良反应[6],具有较高的临床应用价值。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)与脂肪酸合成酶配体(fatty acid synthase ligand,FasL)信号通路(Fas/FasL),可以介导细胞外源性凋亡[7],是调控细胞凋亡的主要途径之一。本研究以4T1细胞株为研究对象,探究益母草碱对Fas/FasL信号通路的调节作用,以及对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡等的影响,以期为乳腺癌的临床治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料 4T1乳腺癌细胞购自中国科学院(上海)细胞库;益母草碱(≥98%)购自上海西格生物科技有限公司;CCK-8试剂盒(CA1210)、凋亡试剂盒(CA1020),购自索莱宝生物科技有限公司;N-cadherin(AF0243)、Vimentin(AF1975)、Fas(AF6861),细胞周期试剂盒(C1052)购自碧云天生物科技有限公司;FasL(sc-19988)购自圣克鲁斯生物技术有限公司;LipofectamineTM 3000 试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖活性的检测:取对数期生长的4T1乳腺癌细胞,制备单细胞悬液,以2×104个/孔接种于96孔板中,加入完全培养基,分别再加入终浓度为10、20、40、80、160 mmol/L的益母草碱,培养箱中培养12、24、48 h,加入10 μL的CCK-8,孵育4 h,使用酶标仪,测定每孔在450 nm处的OD值,计算细胞存活率。

1.2.2 细胞的处理与分组:将4T1乳腺癌细胞分为对照组(Control组)、益母草碱低、中、高浓度组(Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组)、益母草碱高浓度+转染短发夹RNA慢病毒阴性对照组(Leo-H+sh-NC组),益母草碱高浓度+转染Fas短发夹RNA慢病毒组(Leo-H+sh-Fas组)。取对数期4T1乳腺癌细胞,以5×104个/孔接种于24孔板中,培养至贴壁生长(密度70%～90%),加入病毒溶液,按照细胞∶病毒=1∶50,感染细胞24 h,将培养基更换为新鲜的完全培养基,加入嘌呤霉素继续培养1周,在荧光显微镜下观察细胞呈绿色荧光,即获得稳定感染Fas短发夹RNA慢病毒细胞、感染短发夹RNA慢病毒细胞,加入浓度为30 mmol/L的益母草碱,记为Leo-H+sh-Fas组、Leo-H+sh-NC组;Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组细胞给予10、20、30 mmol/L的益母草碱;Control组加入等量DMEM。6组细胞均于37℃(5%CO2)恒温培养箱中培养。

1.2.3 细胞迁移能力:Transwell小室法评价细胞的迁移能力,取各组对数期生长的4T1细胞,加入胰消化酶进行消化,用无血清RPMI-1640培养基配置2×105个/mL的单细胞悬液,取100 μL加入Transwell上室,下室加入500 μL含10%FBS的RPMI-1640培养基,于37℃(5%CO2)恒温培养箱中培养24 h,室温下在4%多聚甲醛中固定20 min,结晶紫染色,在显微镜下随机选取5个视野,观察并记录细胞迁移数目。

1.2.4 细胞凋亡:Hoechst33258染色法观察细胞形态,6组处于对数期4T1细胞,配制浓度为2×105个/mL的单个细胞悬液,接种于6孔板,培养24 h,加入多聚甲醛室温下固定20 min,PBS清洗,加入Hoechst33258染液染色15 min,PBS洗涤多余的染色液,使用荧光倒置显微镜,观察细胞。

1.2.5 细胞凋亡与周期进展:收集6组处于对数期的4T1细胞,加入70%预冷乙醇溶液,固定12 h,部分细胞加入Annexin V-FITC,混匀,再加入PI染液染色5 min,流式机检测细胞凋亡率;另一部分细胞,加入PI染液染色20 min,上流式机检测细胞周期进展。

1.2.6 细胞N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL表达:Western blot法检测,取6组对数期的4T1细胞,加入RIPA,低温处理30 min,4 000 r/min离心20 min,取上清液,测定总蛋白含量;蛋白样本中加入缓冲液,经凝胶电泳、转膜,加入5%脱脂乳粉,封闭120 min;加入一抗N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL(稀释度为1∶1 000),4℃孵育12 h,磷酸缓冲液洗涤3次,加入对用二抗,室温继续孵育2 h,ECL发光显影,以β-actin作为内参蛋白,分析目标蛋白相对表达水平。

1.2.7 荷瘤小鼠模型的建立:取对数期生长的4T1细胞,加入胰消化酶进行消化,配置浓度为5×106个/mL 4T1细胞单细胞悬液,于裸鼠第二对乳腺脂肪垫处接种4T1细胞单细胞悬液0.1 mL[8],接种1周后,小鼠接种处可明显检测到移植瘤,乳腺癌模型建立成功。将小鼠随机分为Control组和Leo组,每组6只,Leo组小鼠每天灌胃150 mg/kg的益母草碱[5],Control组灌胃等量0.9%氯化钠溶液,连续给药4周,每周测量小鼠移植瘤体积,实验结束后,脱颈处死,取出移植瘤检测质量以及检测Fas、FasL蛋白表达。

2 结果

2.1 益母草碱对4T1细胞增殖活性的影响 10、20、40、80、160 mmol/L的益母草碱处理4T1细胞12 h、24 h、48 h,均可显著降低细胞存活率,呈浓度和时间依赖效应,以不同浓度的益母草碱处理4T1细胞12 h后,细胞IC50值(半数抑制浓度)为(53.61±1.729) mmol/L;综合结果,选择浓度为10.0、20.0、40.0 mmol/L的益母草碱,处理细胞12 h,进行后续实验。见表1。

表1 益母草碱对4T1细胞增殖活性的影响 n=6,%,

2.2 益母草碱对4T1细胞迁移与凋亡的影响

2.2.1 益母草碱对4T1细胞迁移能力的影响 与control相比,Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组细胞迁移个数呈浓度依赖性减少(P<0.05);与Leo-H组相比,Leo-H+sh-Fas组细胞迁移个数显著增多(P<0.05)。见图1,表2。

表2 益母草碱对4T1细胞迁移能力及细胞凋亡的影响 n=6,

2.2.2 益母草碱对4T1细胞凋亡的影响:control组细胞形态饱满,呈弥散、微弱蓝色荧光;Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组细胞核、细胞质中均可见浓染致密颗粒块状荧光,且荧光强度逐渐增强;而相比于Leo-H组,Leo-H+sh-Fas组细胞核蓝色荧光减弱。相比于control组,Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组细胞凋亡率显著升高(P<0.05);相比于Leo-H组,Leo-H+sh-Fas组细胞凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2,图2、3。

图2 Hoechst 33258染色观察细胞形态(Hoechst 33258染色×400)

图3 流式细胞术检测细胞的凋亡

2.3 益母草碱对4T1细胞周期进展的影响 相比于Control组,Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组G0/G1期细胞比例显著升高,G2/M期细胞比例及S期细胞比例显著降低(P<0.05),呈浓度依赖效应;相比于Leo-H组,Leo-H+sh-Fas组G0/G1期细胞比例显著降低,G2/M期细胞比例及S期细胞比例显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 益母草碱对4T1细胞周期进展的影响 n=6,%,

2.4 益母草碱对4T1细胞上皮间质转化及Fas、FasL表达的影响 相比于Control组,Leo-L组、Leo-M组、Leo-H组细胞N-cadherin、Vimentin表达显著降低,Fas、FasL表达显著升高,呈浓度依赖性(P<0.05);相比于Leo-H组,Leo-H+sh-Fas组细胞N-cadherin、Vimentin表达显著升高,Fas、FasL表达显著降低(P<0.05)。见图4,表4。

图4 益母草碱对4T1细胞皮间质转化及Fas、FasL表达的影响;A Control组;B Leo-L组;C Leo-M组;D Leo-H组;E Leo-H+sh-NC组;F Leo-H+sh-Fas组

表4 益母草碱对4T1细胞上皮间质转化及Fas、FasL表达的影响 n=6,

2.5 益母草碱对乳腺癌移植瘤生长的影响 小鼠乳腺癌移植瘤实验结果显示,在接种5周后,小鼠第2对乳头处可见明显肿瘤肿块,移植瘤模型建立成功。相比于Control组,Leo组小鼠移植瘤体积及质量显著降低,N-cadherin、Vimentin表达显著降低,Fas、FasL表达显著升高(P<0.05)。见表5、6,图5。

图5 益母草碱对乳腺癌移植瘤N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表达的影响;A Control组;B Leo组

表5 益母草碱对乳腺癌移植瘤生长的影响 n=6,cm3,

表6 益母草碱对乳腺癌移植瘤生长及N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表达的影响 n=6,

3 讨论

目前,乳腺癌已成为发病率最高的恶性肿瘤之一,相对于发达国家,发展中国家以及低收入国家,乳腺癌的生存预后差,病死率高,严重威胁人们生命安全[9-10],寻找价廉、高效的治疗药物,对乳腺癌的防治至关重要。益母草碱来源广泛,毒副作用小,已被大量研究证明具有显著的抗癌活性,如,罗娜等[11]研究发现,益母草碱可以通过调控LINC00461,抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡;Liang等[12]研究表明,益母草碱可以通过调控miR-18a-5p/SLC40A1轴,抑制前列腺癌体外和体内生长。乳腺癌细胞的过度增殖与迁移关系到乳腺癌疾病的复发和转移[13]。本研究中以4T1细胞株为研究对象,使用益母草碱进行处理,结果显示,益母草碱可以显著抑制4T1细胞的增殖与迁移,促进细胞凋亡,荷瘤小鼠实验进一步验证益母草碱可以显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,但机制尚不明确。

癌细胞最显著的特征即为无限增殖,细胞周期是细胞增殖分化的关键,阻滞细胞周期进程是降低细胞增殖能力的有效手段之一[14]。本研究结果显示,益母草碱干预处理后,4T1细胞处于G0/G1期的细胞比例显著升高,S期的细胞比例显著降低,细胞被阻滞于G0/G1期,增殖能力明显被抑制。因此推断,益母草碱可能通过阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是目前肿瘤研究的主要方向之一,受多种信号通路调节,其中Fas/FasL信号通路是非常重要的凋亡途径。Fas存在于多种组织和器官中,是肿瘤坏死因子受体的一种,FasL是Fas的天然受体,参与细胞内多种信号的传递[15]。Fas与FasL结合(Fas/FasL信号通路激活)凋亡途径被激活,引起细胞凋亡,维持机体正常免疫功能[16]。有研究表明,肿瘤组织中Fas表达受到抑制,表达量显著低于癌旁组织和正常组织[17-18],上调Fas水平可以促进肿瘤细胞的凋亡。宋文龙等[19]使用辣椒素激活Fas/FasL信号通路,诱导为癌细胞的凋亡。朱垠等[20]研究发现,Fas/FasL信号通路通路的激活可以抑制大肠癌恶性生物学特性。上皮间质转化(EMT)是肿瘤迁移的关键,EMT的发生伴随着间质细胞蛋白N-cadherin、Vimentin表达上调,阻止EMT进程可以抑制癌细胞的增殖与迁移[21-22]。本研究中益母草碱处理组4T1细胞Fas、FasL表达显著上调,N-cadherin、Vimentin表达显著下调;Leo-H+sh-Fas组中抑制Fas表达,可以逆转益母草碱对4T1细胞增殖、迁移的抑制作用,细胞凋亡率降低。

综上所述,益母草碱可以上调4T1细胞Fas、FasL表达,抑制细胞的增殖、迁移与EMT进程,具有治疗乳腺癌疾病的潜力。但抗癌作用机制复杂,其临床引用仍需进一步研究。