非小细胞肺癌患者血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与病理特征的关系

崔本科 王岩 卢云凤

原发性支气管肺癌(肺癌)是我国最常见和死亡率最高的恶性肿瘤,据国家癌症中心最新报道,2016年我国肺癌发病数和死亡数分别为82.81万例、65.70万例[1]。临床中85%的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),由于缺乏有效的早期诊断方法和治疗方法,导致NSCLC患者死亡率居高不下[2]。寻找相关分子标志物评估NSCLC患者预后至关重要。研究表明,非编码RNA能通过调控多种靶基因参与NSCLC发生发展[3-4]。序列相似性家族138成员B(family with sequence similarity 138 member B,FAM138B)是新近发现的一种长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)。有学者通过RNA测序分析发现,LncRNA FAM138B为肺腺癌潜在的诊断和预后生物标志物[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)-105-5p是一种miRNA,有研究报道miR-105-5p与胃癌、肝癌等恶性肿瘤预后有关[6-7]。同时有学者指出,循环miR-105-5p可作为NSCLC早期诊断标志物[8]。但关于LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与NSCLC病理特征的预后的关系尚未可知。本研究拟探讨NSCLC患者血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与病理特征的预后的关系,以期为改善NSCLC患者预后提供更多思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年12月辽宁省人民医院收治的110例NSCLC患者为NSCLC组,男64例,女46例;年龄24～77岁,平均年龄(60.57±8.63)岁;吸烟63例;病理类型:腺癌37例,鳞癌73例;肿瘤大小:≥5 cm 49例,<5 cm 61例;分化程度:低分化51例,中高分化59例;TNM分期[9]:Ⅰ期28例,Ⅱ期38例,Ⅲ期27例,Ⅳ期17例;淋巴结转移61例。另选取同期60例体检健康者为对照组,男35例,女25例;年龄20～75岁,平均年龄(60.41±7.53)岁;2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准:①经病理检查确诊为NSCLC;②患者或家属书面知情同意;③初次确诊为NSCLC;④入院前未接受抗肿瘤治疗;(2)排除标准:①年龄<18岁;②合并慢阻肺等其他肺部疾病;③合并其他部位恶性肿瘤;④合并急慢性感染;⑤合并免疫、血液、神经系统损害;⑥院内死亡、拒绝接受随访。

1.3 方法 采集NSCLC患者入院翌日晨和对照组体检时空腹肘静脉血3 mL,离心留取上层血清,Trizol试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司,编号:WLA088a)提取血清总RNA,微量分光光度计(武汉艾维斯特科技有限公司,型号:Nano-300)鉴定RNA浓度和纯度合格后,使用反转录试剂盒(广州东盛生物科技有限公司,编号:R1011)合成cDNA。反转录条件:37℃ 1 h,80℃ 5 s。按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,编号:R223-01)进行实时荧光定量聚合酶链式反应。反应体系共20 μL:cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、2×TransStart Top Green qPCR SurperMix 10 μL、无核酸酶水8.5 μL;反应条件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循环40次)。LncRNA FAM138B、miR-105-5p分别以GAPDH、U6为内参校正,2-ΔΔCt法计算血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p相对表达量。LncRNA FAM138B正向引物:5’-GCCTGGAGAGCACCAAGAGGCC-3’;反向引物:5’-ATGGTCCCCAGCCAAAAGCCTC-3’;GAPDH正向引物:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’;反向引物:5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’;miR-105-5p正向引物:5’-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGAC-3’;反向引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 随访 NSCLC患者出院后通过电话或门诊随访3年(第1年3个月1次,第2、3年6个月1次),随访终止事件为患者死亡或随访终点时间(2022年12月),统计3年总生存率。根据NSCLC组织中LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达均值分为高、低表达组。

2 结果

2.1 NSCLC组与对照组血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达比较 NSCLC组血清LncRNA FAM138B表达低于对照组,miR-105-5p表达高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 NSCLC组与对照组血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达比较

2.2 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B与miR-105-5p表达的相关性 经StarBase数据库https://starbase.sysu.edu.cn/预测,LncRNA FAM138B与miR-105-5p存在互补序列。Pearson相关性分析显示,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B与miR-105-5p表达呈负相关(r=-0.770,P<0.001)。见图1。

图1 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B与miR-105-5p表达的线性散点图

2.3 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与NSCLC患者病理特征的关系 不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),不同性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤大小NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与NSCLC患者病理特征的关系

2.4 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达与NSCLC患者生存率的关系 110例NSCLC患者随访3年,失访4例,死亡48例,3年总生存率为56.36%(62/110)。K-M生存曲线分析显示,LncRNA FAM138B高表达组(≥0.871,58例)总生存率67.24%(39/58)高于低表达组(<0.871,52例)的44.23%(23/52);miR-105-5p高表达组(≥1.494,56例)总生存率44.64%(25/56)高于低表达组(<1.494,54例)的68.52%(37/54),差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.339、5.356,P=0.007、0.021)。见图2。

图2 不同LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达的NSCLC患者K-M生存曲线

2.5 NSCLC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析 排除4例失访患者,性别、年龄、吸烟、病理类型、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、LncRNA FAM138B、miR-105-5p为自变量,随访时间为时间变量,生存状态为因变量(死亡/存活=1/0)。多因素Cox回归分析显示,低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移和miR-105-5p≥1.494为NSCLC患者死亡的独立危险因素,LncRNA FAM138B≥0.871为独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 NSCLC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

2.6 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达对NSCLC患者预后的预测价值 ROC曲线分析显示,血清LncRNA FAM138B联合miR-105-5p表达预测NSCLC患者预后的AUC大于LncRNA FAM138B、miR-105-5p单独预测(Z=3.269、3.406,P=0.001、0.001)。见表4,图3。

图3 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达预测NSCLC患者预后的ROC曲线

表4 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达对NSCLC患者预后的预测价值

3 讨论

肺癌是起源于支气管黏膜上皮的恶性肿瘤[2]。近年来随着低剂量螺旋CT的开展和居民健康意识的提高,NSCLC早期诊断率有所提高,但由于早期症状不明显,仅25%患者初诊处于可切除的早中期,多达75%的患者在初诊时处于晚期,失去最佳根治性切除机会[9-10]。尽管近年来基于表皮生长因子受体、ROS原癌基因1、间变性淋巴瘤激酶等的靶向药物[11]和基于程序性死亡受体1等的免疫药物[12]提高了患者客观缓解率,但仅部分NSCLC患者获得临床效益,且随着获得性耐药随着治疗时间的延长越来越多,导致NSCLC患者预后仍然较差。因此发现预后准确预测标志物和潜在的治疗靶点,对提高NSCLC患者临床干预和生存率具有重要意义。

NSCLC是多因素、多基因、多机制参与的复杂过程,表观遗传能通过修饰或改变特定染色体区域结构等因素影响基因表达,进而参与NSCLC发生发展[13]。LncRNA是一类新兴表观遗传调控分子,能通过直接与蛋白质相互作用、与miRNA相互作用形成内源竞争RNA、编码蛋白质或多肽等多种方式调控NSCLC进程。LncRNA FAM138B定位于人染色体2q14.1,Li等[5]首次通过RNA测序证实,LncRNA FAM138B在肺腺癌组织中低表达,且与患者预后生存率降低有关。Zhuo等[14]研究报道,LncRNA FAM138B在肝癌中低表达,上调LncRNA FAM138B能靶向下调miR-765,进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。基于上述研究,我们推测LncRNA FAM138B可能与NSCLC患者预后有关。本研究结果显示,NSCLC组血清LncRNA FAM138B表达降低,与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关,说明LncRNA FAM138B低表达参与NSCLC发生发展。LncRNA FAM138B在NSCLC中低表达可能与其启动子被甲基化而表达沉默有关[15]。而随着LncRNA FAM138B表达降低,可能降低ATP结合盒转运蛋白、环磷酸腺苷,导致NSCLC细胞持续分裂和增殖,促进NSCLC恶性进展[5]。

miRNA也是一类新兴表观遗传调控分子,能通过引发信使RNA的降解或转录后基因沉默,进而参与NSCLC发生发展。miR-105-5p定位于人染色体Xq28,近年来大量研究报道了其与肿瘤的关系,如艾恒玲等[16]研究报道,miR-105-5p能靶向上调XIAP相关因子1促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。上述研究表明,miR-105-5p是一种癌基因。同时有学者报道,miR-105-5p高表达与乳腺癌、原发性骨髓瘤等恶性肿瘤患者的预后不良有关[17]。基于上述研究,我们推测miR-105-5p可能与NSCLC患者预后有关。本研究结果显示,NSCLC组血清miR-105-5p表达升高,这与既往报道结果[8]相符。本结果还显示,NSCLC组血清miR-105-5p表达与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关,说明血清miR-105-5p表达升高参与NSCLC发生发展。miR-105-5p在NSCLC中高表达可能与其启动子被癌基因激活而大量表达有关[8]。而随着miR-105-5p表达升高,能上调GTP酶IMAP家族成员6,促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭[18]。

本研究通过StarBase数据库预测发现,LncRNA FAM138B与miR-105-5p存在互补序列,相关性分析也发现两者在NSCLC患者血清中表达呈负相关,提示LncRNA FAM138B与miR-105-5p可能共同参与NSCLC进程。Gao等[19]实验也显示,上调LncRNA FAM138B表达能靶向抑制miR-105-5p,进而抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭。进一步佐证了本研究结果。本研究通过随访分析LncRNA FAM138B、miR-105-5p与NSCLC患者预后的关系发现,LncRNA FAM138B高表达和miR-105-5p低表达患者3年总生存率显著提升,miR-105-5p≥1.49为NSCLC患者死亡的独立危险因素,LncRNA FAM138B≥0.87为独立保护因素,说明血清LncRNA FAM138B低表达和miR-105-5p高表达与NSCLC患者预后不良密切相关。最后我们通过绘制ROC曲线也发现,血清LncRNA FAM138B联合miR-105-5p表达预测NSCLC患者预后的AUC为0.905,较LncRNA FAM138B、miR-105-5p单独预测的AUC显著增加。说明血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达对NSCLC患者预后具有一定预测价值,且联合检测血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达能提升其预测价值。

综上所述,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B表达降低,miR-105-5p表达升高,与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后有关,血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表达对NSCLC患者预后具有一定预测价值,二者联合预测NSCLC患者预后的价值较高,可能成为NSCLC患者预后的辅助预测指标。