99Tcm标记的PEG4/2PEG4修饰的环状RGD二聚体体内外性质的对比

靳存敬，史继云，刘 妍，靳晓娜，黄金铭，赵慧云，李 方，王 凡，*

1.北京大学 医学同位素研究中心，北京 100191；2.北京协和医院 核医学科，北京 100730

实体肿瘤生长过程中的一个重要环节是新生血管生成(angiogenesis)[1]。在诸多针对血管为靶点的肿瘤治疗中，整合素(integrin)αvβ3受到广泛的关注，它在肿瘤组织新生血管内皮细胞表面和多种恶性肿瘤细胞表面高表达，而在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常组织器官不表达或表达很低，并且在新生血管内皮细胞的粘附、迁移、生长、分化过程中发挥重要作用[2-4]。整合素αvβ3能识别配体分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列，因此为设计含有RGD序列的多肽药物用于整合素αvβ3阳性肿瘤的检测和治疗提供了理论基础[5-6]。

放射性核素标记的RGD多肽已广泛用于肿瘤的显像和治疗研究[7-8]。为了增加RGD多肽与整合素αvβ3的亲和力，人们将“多聚化”的概念引入到RGD多肽放射性药物的研究中[9-10]。另外，为了改善放射性药物的体内药代动力学性质，人们对标记药物进行修饰，包括糖基化、引入水溶性的氨基酸和聚乙二醇(PEG)[7]。本实验室在前期研究中也对有关RGD多肽多聚化以及结构修饰方面的工作进行了报道[11-16]。

本研究以HYNIC为双功能螯合剂，用99Tcm标记PEG4修饰的2种RGD二聚体衍生物：在2个RGD模序(motif)间引入2个PEG4分子；在RGD二聚体与HYNIC双功能螯合剂间引入1个PEG4分子(图1)，比较在不同部位引入PEG4分子对受体配体亲和力的影响，以及对标记药物的药代动力学性质的影响，并对其在正常鼠体内的生物分布进行评价。

图1 RGD环肽二聚体及其衍生物的分子结构Fig.1 Structure of cyclic RGD dimer and its derivatives

1 实验材料

1.1 主要试剂

Na99TcmO4，北京原子高科核技术股份有限公司；HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer，结构示于图1，美国Purdue大学刘爽教授馈赠；三羟甲基甘氨酸(Tricine，N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)、三苯基膦三间磺酸钠(TPPTS，trisodium triphenylphosphine-3,3′,3″-trisulfonate)，美国SIGMA公司；丙酮、乙腈、醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、浓盐酸等，分析纯，北京试剂公司；快速薄层层析-硅胶纸(ITLC-SG)，美国Gelman公司。96孔细胞抽滤板，美国Millipore公司。

1.2 仪器

CRC-15R放射性活度计，美国Capintec公司；1470-002全自动γ计数仪，美国Perkin Elmer公司；AR-2000 放射性薄层扫描仪，美国Bioscan公司；HP1100高效液相色谱(带有Berthold公司的LB-509放射性检测器)，美国安捷伦公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国安捷伦公司。

1.3 实验动物

ICR小白鼠，雌性，约25 g，二级，购自北京大学医学部实验动物部。

2 实验方法

2.1 3种标记化合物的制备

在Eppendorf(EP)管中加入6.50 mg Tricine、5.00 mg TPPTS、20 μL HYNIC偶联的不同的RGD多肽(HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer)(1 g/L)、100 μL琥珀酸缓冲溶液(pH=5.0，25 mmol/L)，最后加入100 μL Na99TcmO4(约74 MBq)，混匀，100 ℃反应20 min，取样进行ITLC和HPLC分析。注射前用Sep-Pak C18小柱对标记物进行纯化，并过0.22 μm滤膜。

2.2 质量控制方法

2.2.1薄层层析法(ITLC) 将标记物点样于ITLC滤纸上，于丙酮展开体系中上行展开，用放射性薄层扫描仪进行扫描，计算标记率和放化纯度。

2.2.2HPLC法 使用LabAlliance HPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm×250 mm,30 nm pore size)，梯度淋洗30 min，流速1.0 mL/min，其中流动相A为醋酸氨缓冲液(NH4OAc，0.025 mol/L，pH=5.0)，B为乙腈，流速为1.0 mL/min，淋洗梯度设定为起始至2 min时90% A和10% B，5 min时85% A和15% B，15 min时80% A和20% B，20—25 min时50% A和50% B，26—30 min回到基线梯度90% A和10% B。

2.3 脂水分配系数的测定

将100 μL标记物加入到含有400 μL磷酸缓冲溶液(PB，pH=7.4，0.05 mol/L)和500 μL正辛醇的EP管中，蜗旋4 h后在8 000 r/min 条件下离心10 min，取等体积有机相和水相测量放射性计数，计算标记物的脂水分配系数P(有机相计数/水相计数)及lgP。

2.4 竞争结合实验

采用Iodogen方法制备125I-c(RGDyK)，比活度约为3.7×1013Bq/mmol。U87MG人神经胶质瘤细胞用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养传代。参考Chen[17]的方法，制细胞悬液，并按每孔105个细胞铺于Multiscreen 96孔抽虑板上，加入约2×105/min的125I-c(RGDyK)以及浓度依次递升的3种RGD多肽(0～1 000 nmol/L)，用结合缓冲液(pH=7.4，500 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L MnCl2和w=1%的牛血清白蛋白)将反应体积调节到200 μL，4 ℃孵育2 h，洗去未结合的125I-c(RGDyK)，收集滤膜并在γ计数仪上进行测量，用GraphPad Prism 4.0(GraphPad软件,SanDiego,CA)软件进行拟合，非线性回归分析计算半数抑制浓度IC50。

2.5 动物实验

2.5.1标记物的药代动力学 选取21只ICR小白鼠，随机分成3组，每组7只。经尾静脉注射100 μL(约370 kBq)3种不同标记物，于注射后1、3、5、7、10、15、20、30、60、120 min取尾静脉血，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每毫升血液的百分注射剂量率Dinj(%ID/mL)，绘制血液清除曲线。

2.5.2标记物在正常小鼠体内的生物分布 将36只ICR小白鼠随机分成3组，每组12只，分别经尾静脉注射100 μL(约370 kBq)3种不同标记物，于注射后0.5、1、4 h按组(每组4只)将实验小鼠处死，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率(%ID/g)。

2.6 统计学分析

使用Prism 4.0软件对实验数据进行分析，P<0.05为有显著性差异。

3 结果和讨论

3.1 标记物的制备及质控

在ITLC分析方法中，标记化合物的Rf=0.0～0.1，游离99Tcm的Rf=0.9～1.0。实验结果表明，3种标记化合物的标记率均达到98%以上。本研究采用TPPTS作为协同配体，它同时具有还原作用，因此在标记过程中不用加入氯化亚锡，这样可以防止锝胶体的生成。

纯化后3种标记物的HPLC分析结果示于图2。由图2可以看出,99Tcm-HYNIC-RGD dimer的保留时间为10.64 min，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的保留时间为10.53 min,99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的保留时间为11.53 min(游离99Tcm的保留时间约为3 min)，3种标记物的放射化学纯度均大于99%。

图2 3种99Tcm标记物的放射性HPLC图谱Fig.2 Radio-HPLC chromatogram of three 99Tcm-labeled compounds

3.2 脂水分配系数

化合物的脂水分配系数可以用于评价标记物的水溶性，脂水分配系数越大说明标记物的脂溶性越好。99Tcm-HYNIC-RGD dimer，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer和99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的lgP分别为-2.24±0.01(n=3)，-2.78±0.04(n=3),-2.52±0.02(n=3)。结果表明，PEG4的引入使2种衍生物的水溶性有所增加。

3.3 竞争结合研究

通过c(RGDyK)、HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer竞争125I-c(RGDyK)与U87MG细胞表面整合素αvβ3的结合，比较了4种配体对整合素αvβ3的亲和力(图3)，它们的IC50值分别为37.29±5.00、8.43±0.62、7.53±0.51、2.90±0.31 nmol/L。IC50值越小，表明亲和力越强。HYNIC-2PEG4-RGD dimer与整合素αvβ3的亲和力约为HYNIC-RGD dimer的2.5倍，约为RGD单体的12倍。HYNIC-PEG4-RGD dimer与HYNIC-RGD dimer相比，亲和力无显著差异。HYNIC-2PEG4-RGD dimer是在2个RGD模序(motif)之间引入2个PEG4分子，从而2个RGD模序之间的距离从6个化学键长增加到38个化学键长，这样2个RGD分子可以同时与细胞表面2个相邻的整合素αvβ3受体相结合，增强了结合的亲和力。这与Wang等[18]的研究结果相一致。HYNIC-PEG4-RGD dimer是在RGD多肽与双功能螯合剂HYNIC之间引入1个PEG4分子，没有改变2个RGD模序之间的距离，因此其与整合素αvβ3的亲和力没有明显改变。

图3 受体竞争结合实验结果Fig.3 Receptor competitive binding assay■——c(RGDyK)，▼——HYNIC-RGD dimer,◆——HYNIC-PEG4-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4 动物实验

3.4.1药代动力学研究 3种标记物在正常小鼠体内的血液清除实验结果示于图4。从图4可以看出，3者均符合二室代谢模型，其中99Tcm-HYNIC-RGD dimer的分布相为0.76 min，消除相为17.10 min；99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的分布相为0.72 min，消除相为24.23 min；99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的分布相为0.62 min，消除相为14.39 min。3种标记物的药代动力学性质相似，并都符合多肽类药物分布清除快的特点。

图4 3种99Tcm标记物的血液清除曲线Fig.4 Blood clearance of three 99Tcm-labeled compounds▲——HYNIC-PEG4-RGD dimer,■——HYNIC-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4.2药物在正常鼠体内的生物分布 3种标记物在正常小鼠体内的生物分布数据列于表1。从表1可以看到，注射后0.5 h99Tcm-HYNIC-

PEG4-RGD dimer((17.61±1.87)%ID/g)在肾的摄取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((13.85±1.91)%ID/g,P<0.05)，其余脏器各标记物组别间没有差异，这表明PEG4作为药代动力学修饰分子增强了标记物的亲水性，从而增强了其从肾脏的排泄；注射后4 h肠对99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer((4.01±0.90)%ID/g)的摄取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((2.12±0.71)%ID/g，P<0.05)，我们考虑这是否是由于肠中有整合素αvβ3的表达，2个PEG4的引入明显提高了配体受体的亲和力，从而增加了肠的摄取，这需要通过Western Blot实验进一步验证；肾对99Tcm-HYNIC-RGD dimer的摄取低于其余2种标记物，这与脂水分配系数测定结果相一致，PEG4的引入使2种衍生物的水溶性有所增加。

表1 3种99Tcm标记物的正常鼠生物分布Table 1 Biodistribution of three 99Tcm-labeled compounds in normal mice

注(Note)：n=4

4 结 论

在本研究中，3种99Tcm标记的RGD二聚体在所用标记条件下均获得大于98%的标记率；竞争结合实验结果表明，HYNIC-2PEG4-RGD dimer与整合素αvβ3的亲和力明显高于其它2种化合物；药代动力学的实验结果验证了3种多肽类药物的代谢特点，均有较快的分布相和消除相；正常鼠体内生物分布结果表明，PEG4的引入增强了标记物的水溶性。99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer具有更好的体内外性质，作为一种潜在的肿瘤显像剂，具有进一步研究开发的价值。

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