白色念球菌疫苗研究状态综述

隋凤湖

白色念珠菌（C．albicans）是一种可寄生在人体的口腔、胃肠道、女性生殖道黏膜及体表潮湿部位的正常菌群之一，同时又是重要的机会性致病菌。一旦机体的免疫力下降或者正常的菌群平衡被破坏，它就会在黏膜下大量繁殖，侵入深层组织，可引起反复浅表性黏膜感染或严重的系统性感染。据英国医学真菌学会（BSMM）和英国抗微生物化疗协会（BSAC）所属的95家微生物实验室的统计资料，在英国每年根据实验室提供的资料协助诊断的念珠菌血症就达500～600万例，远远高于其他真菌感染。在念珠菌感染中，白色念珠菌占60%以上。这些情况的出现与免疫抑制剂、广谱抗生素的大量应用，导管、插管的普遍开展，癌症患者的放疗和化疗，器官移植的广泛实施，免疫抑制患者尤其是HIV感染患者的不断增多等因素密切相关。美国疾病预防控制中心于1992至1993年进行的一项流行病学调查显示：念珠菌菌血症的年发病率为8/10万～10/10万，病死率29%～40%。白色念珠菌已成为影响人们生活质量，威胁生命健康的重 要条件致病性真菌之一。目前由于抗真菌药物的应用又使得耐药菌株不断增多。因此，选择良好的疫苗激发机体的适应性和固有性免疫将成为白色念珠菌感染的重要策略。笔者就目前有关白色念珠菌疫苗研究进展作一简要综述。

1 全菌疫苗

白色念珠菌的感染是多途径的，又有多态性，同时又有很多血清型的存在。白色念珠菌的全菌疫苗一般达不到预期的接种效果。但对局部黏膜免疫有一定的作用。Fukuizumi等[1]为验证感染性全菌疫苗的可能性，将经灭活的白色念珠菌在家兔扁桃体上接种，诱导产生了抑制白色念珠菌与上皮细胞黏附的抗体，证明用常见血清型的全菌灭活疫苗可以预防口腔念珠菌病。

2 疫苗候选抗原

白色念珠菌是双相菌，具有多种致病因子。包括黏附蛋白、侵袭性蛋白酶和表面受体等。其中大多数是抗原物质，能够诱导机体产生免疫反应。作为疫苗候选抗原应具有：①良好的免疫原性；②可刺激机体产生保护性的细胞免疫和体液免疫。目前研究较多的有以下几种抗原：热休克蛋白90（Hsp90）、凝集样蛋白（Alsp）、甘露糖蛋白65（MP65），由于它们具有较好的免疫原性，能够使动物体获得抗白色念珠菌的免疫保护作用，因而可作为该菌疫苗的候选抗原。

2.1 Hsp90

Hsp90是存在于念珠菌细胞壁与胞质的一种蛋白质。Fukuizumi等从系统性念珠菌感染的患者血清中分离Hsp90（相对分子质量90000）和它的降解片段（相对分子质量47000）。经检测，92%系统性白色念珠菌感染患者和恢复患者均产生了高滴度的针对47000（相对分子质量）分子的抗体；然而，病情恶化患者的血清中47000（相对分子质量）分子抗原滴度升高，不含有或者仅含有微量的抗47000（相对分子质量）分子抗体。推测抗Hsp90的抗体具有保护作用。Hsp90或其特异性抗体，不仅为诊断系统性念珠菌感染提供了一种非常有用的血清学标志物，而且Hsp90有可能成为防治白色念珠菌感染的疫苗候选抗原。

2.2 Alsp

Als1p是白色念珠菌凝集样基因1编码的一种蛋白，其作用是负责白色念珠菌与人细胞的结合。Als1蛋白结构与免疫球蛋白超家族同源，其蛋白特异性由其N末端决定。白色念珠菌Als蛋白家族至少有9个基因编码的蛋白组成，其中Als1和Als3都是编码黏附素的基因，Als1蛋白主要黏附内皮细胞，而Als3蛋白黏附上皮细胞。因为此蛋白表达在宿主细胞表面，其诱导产生的抗体能够抵抗白色念珠菌与内皮细胞的黏附，所以Alslp或Als3p的重组N末端区域（rAlsp-N或rAls3p-N）是很好的疫苗候选蛋白。

2.3 MP65

白色念珠菌细胞壁中激发机体免疫能力的成分主要是蛋白和糖蛋白，而糖蛋白中最主要的就是甘露糖蛋白。MP65是从白色念珠菌细胞壁中纯化出来的65000的甘露糖蛋白，具有很好的免疫原性，介导抗白色念珠菌的免疫反应。体外研究证明MP65能诱导人类T细胞介导的免疫反应。而DC细胞和Th细胞的激活密切相关。DC细胞是通过甘露糖、岩藻糖受体、TLR2和TLR4识别念珠菌细胞，MP65激活DC并且诱导TNF-α、IL-6的产生及IL-12基因的表达。MP65通过刺激协同刺激分子的表达增加和CD14、FcR的表达减少而诱导DC成熟，从而启动抗原提呈，进一步在其诱导产生的细胞分子作用下激活Th1．细胞。另外也证明MP65的核心蛋白和甘露糖部分都是诱导机体保护性免疫反应的必要成分，它们的作用也是不重叠的。这一切提示，MP65也有望成为人类预防白色念珠菌感染的疫苗候选抗原。

3 蛋白疫苗

随着生物化学、分子生物学和免疫学的发展，利用新的生化技术、物理方法和基因工程技术可将上述念珠菌中疫苗候选抗原进行克隆、表达和纯化，制备成重组蛋白疫苗。

Raska等将重组的Hsp90蛋白（rHsp90）从不同途径（皮内、鼻腔内和静脉内）免疫BALB/c小鼠，rHsp90能够明显提高小鼠血清和阴道内rHsp90特异性的IgG和IgA水平，并且在体外可升高rHsp90特异的脾细胞反应。小鼠动物模型体内研究显示：MP65能诱导迟发型超敏反应和Thl型细胞因子的产生，并对致死性念珠菌感染有部分保护作用。

Ibrahim等构建了rAlslp-N蛋白，并将其免疫BALB/c小鼠，证明，rAlslp-N。保护性剂量可以增加对Thl型细胞的刺激并诱导体内的迟发型超敏反应。用白色念珠菌的致死量攻击后，可以提高小鼠的存活率。而抗体的滴度与保护性没有相关性。说明此蛋白在抗白色念珠菌免疫中是刺激细胞介导的细胞免疫而不是体液免疫。另外，rAlslp-N也可以提高远交系小鼠抗播散性白色念珠菌病的保护性，免疫后可以抵抗多种毒力的白色念珠菌和非念珠菌的感染。rAlslp-N的皮下免疫效果更好，对免疫缺陷小鼠的侵袭性感染也有很好的保护作用。Spellberg等比较了rAlsl p-N和rAls3p-N两种蛋白对小鼠播散性念珠菌病、口咽部及阴道念珠菌病的预防作用，发现rAls3p-N抗播散性念珠菌病的作用与rAlsl p-N的效果相同，但是抗口腔和阴道黏膜的念珠菌病比rAlsl p-N效果更好。因此rAlsl p-N有望成为一个更好的同时预防播散性和黏膜念珠菌病的候选蛋白疫苗。

4 多肽疫苗

多肽疫苗是研究者根据有效免疫原的氨基酸序列，设计和合成的免疫原性多肽，试图以最小的免疫原性肽来激发有效的特异性免疫应答。Matthews和Burnie钊绘制出Hsp90的C末端的连续表位C、B和H表位。其中表位C，由LKVIRK6种氨基酸组成，用免疫印迹检测，47000反应的患者血清均识别表位C。Matthews和Burnie又以化学合成的LKVIRK表位与匙孔蓝蛋白耦联物作为免疫原，再用免疫动物获得的抗Hsp90多克隆抗体和单克隆抗体对感染小鼠进行免疫治疗，结果表明抗体治疗能明显降低系统性念珠菌感染小鼠的病死率，并使小鼠肾脏感染的真菌数量显著减少。Yang等利用展示有LKVIRK表位（C表位）的杂合噬菌体作为抗原，免疫C57BL/6J小鼠，然后在小鼠的系统性念珠菌感染模型中评价其免疫保护作用。结果证明该杂合噬菌体能够诱导C57BL/6J小鼠产生高滴度的抗Htsp90抗体，而且对系统性念珠菌感染的小鼠具有免疫保护作用。说明展示有白色念珠菌LKVIRK表位的杂合噬菌体有可能成为一种新形式的真菌疫苗。

5 糖结合疫苗

白色念珠菌的感染是多种途径，无论是蛋白还是糖类分子，大多数处于研究阶段，还未应用于人体。另外，白色念珠菌和其他真菌作为疫苗的候选蛋白大多都含有糖类成分，而这些糖类成分都与免疫反应的激活密切相关，其中大多数都是先通过结合固有性免疫细胞表面受体，激活固有性免疫细胞，再进一步诱导适应性免疫的发生。如甘露糖和葡聚糖，都是多种真菌细胞壁的成分，它们都是通过识别不同的模式识别受体（PRR）而发挥免疫作用的。如β-葡聚糖，通过识别TLR2、Dectin-1和TLR4来激活巨噬细胞和单核细胞，启动免疫反应。因为β-葡聚糖存在广泛，可以考虑用这种糖类免疫机体，使其获得抗多种真菌感染的免疫保护作用。Torosantucci等用一种与病原性真菌无关的昆布多糖，它来源于棕色海藻，有β-葡聚糖的特性，可替代真菌成为免疫原。但是由于昆布多糖本身免疫原性较弱，他们将白喉毒素CRMl97（是一种用于人体的安全的蛋白疫苗）与之结合，制备成一种糖-蛋白结合性疫苗（Lam-CRM）。用这种疫苗免疫小鼠，小鼠血清中产生了抗β-葡聚糖的IgM和IgG型的抗体，经2倍的LD50剂量的白色念珠菌攻击后，对系统性感染的小鼠有很好的免疫保护作用，延长了小鼠的存活时间，降低了病死率。另外，将免疫过的小鼠血清转移给未免疫的小鼠后，可将免疫保护作用转移。同时他们将此疫苗给家兔阴道内接种和鼻内接种，获得了相似的效果，阴道液中均检测到了高滴度的抗β-葡聚糖的IgG抗体，对阴道的念珠菌病有很好的保护作用。Lam-CRM免疫血清及抗 -葡聚糖的单克隆抗体可以体外抑制真菌菌丝的生长。综上所述，Lam-CRM这种糖结合疫苗不仅可以预防念珠菌病，还可以用于治疗。是一种预防性与治疗性相结合的与病原体无关的有前景的新型疫苗形式。

6 DNA疫苗

DNA疫苗目前不仅是抗感染疫苗研究的热点，也是基因治疗研究的热点。已知在多种微生物感染疫苗的研究中，DNA疫苗在动物体内都产生了较好的免疫效果，如结核杆菌疫苗、乙型肝炎病毒疫苗等，它既可以诱导体液免疫又可诱导细胞免疫。比较而言，DNA疫苗诱导的免疫中细胞免疫较强。白色念珠菌感染是多途径的，针对不同菌体抗原的免疫产生的效果不同。对于机体而言，清除真菌是最重要的。Raska等以Hsp90为抗原，比较了Hsp90的蛋白免疫和DNA免疫对预防系统性念珠菌感染小鼠的免疫效果。他们从临床分离的白色念珠菌中克隆出Hsp90的mRNA，转化成cDNA后克隆至pVAXl载体上，以肌内注射和皮内注射2种方式免疫小鼠，与相应重组蛋白免疫作比较。皮内注射DNA的小鼠对白色念珠菌的感染有保护作用，体内抗Hsp90的IgG抗体水平与小鼠存活率呈正相关。而肌内注射组对系统性念珠菌感染没有保护性。

综上所述，不同形式的白色念珠菌疫苗应用都具有很好的免疫保护作用，但目前以Hsp90和Alslp为靶点的白色念珠菌疫苗还处在动物实验研究阶段，以MP65为靶点的疫苗还处在体外实验研究阶段，因此距离临床应用还有大量的工作要做。但从白色念珠菌感染过程中的关键分子和步骤入手，研究和开发一种既能激活固有性免疫，又能诱导适应性免疫的疫苗，对预防越来越广泛的白色念珠菌病，以及提高AIDS患者抗真菌感染的能力和生存能力都具有重要意义。

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