白藜芦醇制备技术进展

闻永举， 梁爱军， 申秀丽

(江西宜春学院，江西宜春336000)

白藜芦醇(resveratrol)，化学名为(E)-3，4′，5 三羟基二苯乙烯，又名芪三酚，具有较强抗癌、抗菌、抗氧化、抗炎、抗过敏、降血脂等方面的药理作用。广泛地应用药品、食品、保健品及化妆品等领域。1998年美国艾尔·敏德尔编撰《抗衰老圣典》，将白藜芦醇列为“100种最热门有效抗衰老物质”之一［1］。白藜芦醇作为一种贵重化合物，纯度98%白藜芦醇每公斤高达3 000多元，市场年需求量约100吨。当前市场上能供应白藜芦醇的量约为20吨，尚有80吨的缺口，其市场前景较好。近年来，出现了不少白藜芦醇制备的新方法、新技术。本文对其制备方法作一综述，以便更好的开发利用白藜芦醇。

白藜芦醇制备技术通过3个途径实现，分别是从天然植物中提取、利用植物组织细胞培养技术生产白黎芦醇及化学合成。

1 植物提取

随着植化技术的提高及对各种植物成分的深入研究，目前至少己经在21个科、31个属的72种植物发现白黎芦醇。许多常见的药用植物，如决明、黎芦、虎杖等，有的甚至是食物，如葡萄、花生。其中以虎杖、花生、葡萄中含量较为丰富，主要以反式存在。由于白藜芦醇及白藜芦醇苷在虎杖中含量最高，虎杖又比较便宜。目前，白藜芦醇及白藜芦醇苷主要是从虎杖中提取制备。

1.1 酶解白藜芦醇苷制备白藜芦醇

侯团章等将新鲜虎杖打浆，在10～50℃放置24～120 h，然后用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯经过纯化制得白藜芦醇［2］。罗何生等将虎杖进行乙醇提取，回收乙醇溶液，加入纤维素酶进行酶解虎杖苷，酶解液用乙酸乙酯萃取，得白藜芦醇粗品，经进一步精制得白藜芦醇精品。其精品每1 kg虎杖可收白藜芦醇在3.6～5.6 g［3］。刘庚贵等将虎杖用乙醇提取，减压回收溶剂，经虎杖专用酶45～50℃恒温酶解4～5 d，升温至85～100℃，维持2 min，滤渣为白藜芦醇粗品，再用虎杖专用絮凝剂沉淀，过滤，清液经氧化铝层析，乙醇水重结晶即得白藜芦醇，收率达0.6%以上［4］。蒋洪武以虎杖粉末为原料，用复合酶在恒温下进行酶解反应48～72 h获得酶解原料;再用溶剂萃取、浓缩获得含白藜芦醇的半成品，再经精制即得［5］。杨庆利等利用花生根发酵产生的纤维素酶酶解花生根提取白藜芦醇。提取条件温和，极大的提高了白藜芦醇得率，极大地降低了白藜芦醇的生产成本，更适合大规模化工业生产［6］。宋欣等利用微生物产生的β-葡萄糖苷酶粗酶液对白藜芦醇苷进行转化，收率高，产物较单一，白藜芦醇的分离提取步骤简单［7］。

1.2 发酵或微生物转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇

曹庸等将虎杖在专用微生物15～45℃下培养24～48 h，使虎杖苷转化白藜芦醇，专用微生物为酵母+青霉素种或酵母+短小芽孢杆菌。然后用40%乙醇-烷基醇(95∶5)混合溶剂提取，减压回收提取液，经过柱层析，得纯度大于95%白藜芦醇和一定纯度副产物的大黄素［8］。曹庸将虎杖粉末加入适量白藜芦醇专用微生物作转化诱导剂转化，采用40%乙醇-5%4-甲基-2-戊醇(95∶5)作为提取溶剂，真空浓缩，经柱层析，得纯度为95.1%白藜芦醇及一定纯度副产品大黄素［9］。修志龙等将原料粉碎，加入碳源和氮源制成种子培养基和发酵培养基;接种米曲霉(Aspergillus oryzae)，通气搅拌发酵;微波辅助提取发酵液。利用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，简化了工艺和操作程序，缩短了生产周期，大大提高了白藜芦醇的收率，降低了生产成本［10］。皱贤德等将虎杖在20～50℃温浸发酵24～96 h，然后用溶剂萃取、浓缩获得白藜芦醇半成品［11］。游松等对虎杖药材进行醇提、液液萃取后，萃取物经大孔吸附树脂和氧化铝柱层析进行纯化;利用二步发酵法筛选白藜芦醇苷的转化菌，并利用该菌对白藜芦醇苷进行转化，用TLC和HPLC法跟踪检测白藜芦醇苷和转化产物白藜芦醇，滤除转化产物后，滤液上大孔吸附树脂，乙醇洗脱，即得白藜芦醇，建立了白藜芦醇新的途径［12］。

1.3 酸水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇

余淑娴等采用热水提取虎杖苷，通过酸催化水解，酸水解液上大孔吸附树脂进行吸附纯化处理，以乙醇-水作为洗脱剂，回收乙醇，经过活性碳脱色处理。每500 g虎杖白藜芦醇收率0.39～0.42 g，纯度大于98%［13］。刘新荣等利用盐酸水解反式白藜芦醇苷制备反式白藜芦醇，其酸水解温度为55～75℃，水解产物经硅胶层析分离反式白藜芦醇。与现有的酶法技术相比，转化率高为45%，水解时间短为1～3 h［14］。

1.4 有机溶剂萃取及柱色谱分离

成小飞将虎杖进行有机溶剂提取，回收有机溶剂，加水溶解，上清液经过乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，粗品经水解，水解产物在经氧化铝高压柱层析可制纯度大于99%白藜芦醇。［15］。蔡向源等将虎杖用乙醇提取，减压回收溶剂，浸膏拌样，经硅胶进行层析，经乙醇-乙酸乙酯-石油醚在60～90℃的温度洗脱，回收溶剂，经乙醇重结晶，得白藜芦醇［16］。孙狄等将虎杖用有机溶剂提取，经萃取、浓缩、硅胶柱层析、结晶和重结晶，得到高达97%以上白藜芦醇和白藜芦醇苷。白藜芦醇苷收率70%，白藜芦醇60%［17］。韩笑等将虎杖用有机溶剂提取，经硅胶柱层析，得到高达90%以上白藜芦醇和70%以上白藜芦醇苷。再经高速逆流色谱分离，得到纯度高于99%白藜芦醇及其苷［18］。代光辉等采用乙醇提取，回收乙醇，通过乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，以纤维素作为固定相，以甲醇作为流动相，进行层析制备。白藜芦醇收率为0.4%［19］。张浩将虎杖经过水浸泡后，进行乙醇提取，回收乙醇溶液，经过乙醇溶解除杂，活性碳吸附除杂，得白藜芦醇［20］。

1.5 大孔吸附树脂或聚酰胺纯化白藜芦醇苷及白藜芦醇

赵金华等采用乙醇提取，回收乙醇，通过聚酰胺色谱柱，经过20%乙醇除杂，30% ～60%乙醇洗脱虎杖苷，60% ～95%乙醇洗脱白藜芦醇，并应用工业化研究，结果较好［21］。许汉林等对 AB-8、H1020、D101、X-5 树脂、HPD100、SP850、SP825型号树脂进行筛选，结果SP850树脂饱和吸附量可达16.12 mg/g，吸附率为93.29%，以75%的乙醇为洗脱液，解吸量为77.44%，明显优于其他树脂［22］。朱立贤等对聚酰胺、X-5、NKA-Ⅱ、D4006、AB-8、NKA、D4020、S-8、NKA-9、D3520、H1020、H103、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、DA-201、DM-301、DS-401、YPR-Ⅱ、D1300、CAD-45(1)、CAD-40、CAD-45(2)、DM-11、DM-130、ADS-7、ADS-8、ADS-17树脂进行研究，从中选出H103树脂具有较大吸附量和解吸率。适合的上柱浓度为0.715 7 mg/mL，上柱液的pH为4.10，上柱液流速为2 BV/h。4倍树脂床体积的80%乙醇以1 BV/h的流速进行洗脱即可基本将白藜芦醇完全从H103树脂上解吸下来。再用聚酞胺柱色谱分离，最终得到高纯度的白黎芦醇和白黎芦醇苷产品［23，24］。向海艳等对S-8、聚酰胺、NKA-9、NKA-II、AB-8、X-5、D-140、D101 树脂进行研究，结果从中筛选树脂AB-8树脂对白藜芦醇苷有较好的吸附分离性能，适合于虎杖中白藜芦醇苷的提纯，经该树脂吸附解吸，饱和吸附量可达25.8 mg/g，解吸率达83.2%［25］。向海艳等对 S-8、聚酰胺、NKA-9、NKA-II、AB-8、X-5、D-140、D101 树脂进行研究。结果NKA-I树脂对白黎芦醇有较好的吸附分离效果，适合于虎杖中白黎芦醇的提纯，经该树脂吸附解吸，饱和吸附量可达31.6 mg/g，解吸率达91%［26］。瞿卫林等对树脂 D-101、DA-201、DB-301;ADS-8、ADS-21、ADS-F8、YWD-01B、YWD-03、YWD-04、YWD-06、YWD-09、YWD-12C、HPD-400、HPD-500、HPD-700、HPD-800、NKA-9、聚酰胺进行研究。结果:HPD-500树脂对白藜芦醇的吸附量可达58.67 mg/g，解吸率为92.6%，经大孔吸附树脂的吸附与解吸，白藜芦醇的含量由粗提物中9.25%提高至39.5%［27］。

1.6 采用超临界CO2萃取

曹庸采用超临界CO2作为萃取剂，加入无水乙醇和2-丙醇作为改性剂，萃取压力35～25 Mpa、温度60～40℃，解析釜压力8～5 Mpa，温度60～40℃，回收溶剂，经过柱层析分离得纯度95.1%白藜芦醇［28］。

1.7 大孔吸附树脂及高速逆流分配色谱

柳仁民等将虎杖用乙醇提取，减压回收溶剂，上大孔吸附树脂，先以5%乙醇除杂，然后以15%乙醇洗脱白藜芦醇苷，20%乙醇洗脱白藜芦醇。减压回收醇提取液。白藜芦醇粗提取物经过石油醚-乙酸乙酯-水(1∶5∶5)高速逆流色谱分离纯化白藜芦醇苷;白藜芦醇粗产物经过石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶5∶4∶6)高速逆流色谱分离纯化白藜芦醇［29］。

1.8 大孔吸附树脂-有机溶剂萃取-硅胶柱色谱

黄纪念等将干花生根粉碎后用有机溶剂提取，提取液抽滤、回收溶剂得初提物，用水加热溶解，加入乙酸乙酯萃取，调pH值为7.0～11.0，静置、抽滤、减压浓缩，得到的白藜芦醇粗提物用大孔吸附树脂进行吸附，不同浓度乙醇洗脱，薄层色谱法跟踪检测，将收集的白藜芦醇段洗脱液浓缩回收乙醇，得到含量35%以上的白藜芦醇半成品，上硅胶层析柱，用不同体积比例的乙酸乙酯、氯仿进行梯度洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集的白藜芦醇段洗脱液采用活性炭脱色、重结晶等方法精制得到含量98%以上的白藜芦醇［30］。

2 化学合成法制备白藜芦醇

侯建等以3，5-二羟基苯甲酸为原料，保护羟基后，经原位生成的B2H6替代LiAlH4还原、氯化后，与亚磷酸三乙酯反应生成中间体，中间体再与茴香醛进行Wittig-Horner反应，最后用吡啶盐酸盐替代BBr3脱保护白藜芦醇，总收率为43.4%［31］。潘华君以3，5-二羟基苯甲酸为起始原料，经与甲醇酯化，氯苄的羟基保护，氢化锂铝还原，三溴化磷嗅化，得到反应中间产物3，5-二苄氧基溴苄，再与亚磷酸三乙酯经过Arbuzov重排，生成3，5-二苄氧基节磷酸二乙酯，再与4′-甲氧基苯甲醛经Wittig-Horner缩合反应得到3，5-二苄氧基-4′-甲氧基-(E)-二苯乙烯，再以BBr3/CH2Cl2脱去保护基团等七步反应成功合成了单一反式结构的-(E)-白黎芦醇，总收率45.4%［32］。邹永等通过3，5-二甲氧基苯甲醛与对甲氧基苯乙腈在醇钠催化下发生缩合反应，形成二苯乙烯骨架结构，经水解反应、脱羧反应，得到顺和反式-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯混合物，然后分离或异构化得到顺或反式3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯，最后通过脱甲基反应得到顺式白藜芦醇或反式白藜芦醇［33］。晏日安等将HBr气体通入对甲氧基苄醇的苯溶液中，反应制得对甲氧基苄基溴;所得对甲氧基苄基溴与亚磷酸三乙酯混反应，制得对甲氧基苄基磷酸二乙酯;所得对甲氧基苄基磷酸二乙酯与氨基钠、3，5-二甲氧基苯甲醛反应，得(E)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯;(E)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯与AlI3得白藜芦醇［34］。王文峰等以3，5-二甲氧基苄溴与金属镁反应生成格式试剂3，5-二甲氧基苄溴化镁，3，5-二甲氧基苄溴化镁与茴香醛进行亲核加成反应生成 3，5，4′-三甲氧基二苯乙醇，3，5，4′-三甲氧基二苯乙醇脱水生成 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯脱甲基得到白藜芦醇［35］。陈新以3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯为原料，以三甲苯为溶剂，氢醌为抗氧化剂，用三氯化铝/吡啶为催化剂的去甲基工艺合成白藜芦醇，同时采用市售便宜的对甲氧基氯苄与3，5-二甲氧基苯甲醛进行Wittig反应，制备中间体 3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯［36］。龚祝南等以3，5-甲氧基苯甲醇在DMF-三乙胺混合溶剂中进行氯代反应后得到3，5-甲氧基氯苄，经过与亚磷酸三乙酯反应后得到3，5-甲氧基苄基磷酸二乙酯，反应产物与大茴香醛进行Witting反应后得到3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯，在 N-甲基苯胺与三氯化铝的催化下脱甲氧基反应生成反式白藜芦醇［37］。都建立等以3，5-二甲氧基苯甲醛为起始原料，在无水三氯化铝的作用下经脱甲基反应得到3，5-二羟基苯甲醛，然后与对羟基苯乙酸在乙酸酐和三乙胺的作用下发生Perkin 缩合得到(E)-2-(4′-羟基苯基)-3-(3′，5′-二羟基苯基)丙烯酸，最后经同步的脱羧-异构化反应得到目标化合物白藜芦醇，总收率41.9%。在合成过程中，羟基无需保护和去保护、无需昂贵的脱甲基试剂，且脱羧和异构化一步完成，仅3步反应就成功合成了白藜芦醇［38］。

3 生物工程

尉亚辉将含有白藜芦醇植物体材料通过愈伤组织诱导、单细胞分离、高产细胞株的诱导筛选、扩大培养及大量细胞的生产培养，最终得到含有白藜芦醇的细胞产品［39］。其工艺路线为材料外植体，经诱导愈伤组织产生单细胞，对单细胞进行分离，筛选出高产细胞株，再经细胞固体培养，得到大量克隆细胞;或高产细胞株经分离获得高产单细胞，高产单细胞再经细胞悬浮培养，即可得到大量克隆细胞。最后对克隆细胞进行提取，分离，可以得到白藜芦醇。以实例说明该生物工程技术:(1)材料外植体:筛选成熟的葡萄果穗，在流水中冲洗4 h后，用双氧水浸泡10 min，用无菌水冲洗。配制MS或B5固体培养基附加10 ml/L葡萄汁，0.6 mg/L的NAA、4.5 mg/L的6-BA，分装灭菌。(2)诱导愈伤组织:将葡萄材料切成0.5 cm大小的块，灭菌后接入培养基中培养，在25℃黑暗条件下培养36 h，然后光照下培养诱导愈伤组织。3周后分割愈伤组织，并转移至新培养基伤继续培养。继代繁殖每2～3周进行一次。(3)获取单细胞:取10 g新鲜幼嫩的愈伤组织，置入100 mL培养液中，经25℃黑暗14 h。低速搅拌6 min，用100目尼龙网过滤，经清洗后得到分离的单细胞。(4)高产细胞的筛选:将单细胞转移到固体培养基上进行筛选培养，其培养基内增加三氯化铝1 mg/L和半乳糖二酸300 mg/L的诱导剂，再通过物理和化学手段对其进行诱变，筛选出白藜芦醇含量高的细胞株。经分离后再进行诱导筛选培养，重复2～5次，最终确定高产细胞株。(5)细胞固体培养:高产细胞株分割多块，转移含有诱导剂的固体培养基上进行扩大培养，3～5周为一个周期，可以不断重复扩大。(6)大量克隆细胞:将扩大培养细胞团分割，转移至含有诱导剂的固体培养基上进行大量细胞的生产，其培养基内NAA的含量为4 mg/L、6-BA的含量为2 mg/L;经30℃条件下培养3～5周，收集细胞团为细胞产品，可用于白藜芦醇的提取或直接制成产品。

4 讨论

白藜芦醇通过化学合成，每公斤成本3 000多元，合成过程产生较多废渣、废液，对环境多有污染，这方面还有待于进一步的研究。虎杖中白藜芦醇苷含量可高达3%，我国大部分地区均产虎杖，虎杖资源非常丰富。虎杖苷完全转化白藜芦醇比例为1∶0.57。因此，国内多对虎杖进行酶解，使白藜芦醇苷酶解白藜芦醇。然后再进行分离提纯。虎杖中含有多种酶，在白藜芦醇苷酶解白藜芦醇时，其他苷类也被酶解成苷元。由于白藜芦醇苷远较白藜芦醇稳定，而且酶解之后产物较为复杂，分离成本偏高。白藜芦醇苷极性较大，很容易通过树脂或聚酰胺分离出纯品，能否对白藜芦醇苷纯品进行酶解或转化，这方面的文献报道很少，不失为研究的一个方向。其次，白藜芦醇或白藜芦醇苷的提取纯化有传统的溶剂萃取，将逐渐被树脂、聚酰胺富集、纯化所代替，而且出现了树脂-树脂或树脂-聚酰胺串联富集白藜芦醇苷，其分离纯化效果更好。相比单一树脂纯化，树脂-树脂串联富集文献少，而且公开技术参数不全，这方面也需要进一步研究。

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