培养法和染色法对养殖环境中微生物气溶胶浓度的检测

刘敬博,柴同杰,苗增民,刘晓敏

(山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018)

生物气溶胶是大气气溶胶中有活性的部分,主要包括细菌、真菌和病毒等,它可以借助空气介质扩散和传输,引发人类急、慢性疾病,如传染病、过敏症或中毒以及动植物疾病的流行传播[1]。畜禽舍环境中产生的微生物气溶胶不仅对畜禽和养殖人员的健康造成威胁,而且还会对外界环境造成污染[2]。许多重大畜禽烈性传染病是通过气溶胶进行传播的,其病原微生物能够借助气溶胶传播到很远的距离,威胁性大,且较难控制。因此,检测不同养殖环境中微生物气溶胶浓度,并获知其污染状况意义重大。

微生物气溶胶浓度的检测方法较多,传统的方法是培养后的菌落计数(cfu/m3空气),近年来,随着分子生物学研究技术方法的进步,常采用DNA染色后的直接镜检计数(如DAPI,吖啶橙)和荧光原位杂交(FISH),以及更直接的定量PCR技术等[3-6]。目前最常用的是培养后的菌落计数,但该方法不能准确反映微生物的实际含量。据报道,仅有0.3%～10%的微生物可被培养计数[3,7-8]。然而,DAPI染色法已被认为是一种标准的测定浮游微生物总量的方法,而且操作简便,计数准确[9-10]。

就养殖环境而言,目前还缺乏其清洁指标,准确监测不同环境微生物气溶胶的含量,有助于调整畜禽生产和减少对健康的危害。本研究采用DNA染色后直接镜检计数的方法来测定养殖环境内微生物气溶胶的浓度,得到较理想的结果。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究于2009年6月～2009年12月在泰安、枣庄两地分别对2个鸡舍、1个猪舍和2个牛舍进行检测。将国际标准的AGI-30空气采样器置于畜禽舍中央,离地面1.0 m左右。以50 mL的无菌生理盐水为采样介质,采样时气流速度为12.5 L/min,驱动时间为20 min。在采样的同时,记录舍内温热指标。

1.2 培养法计数

取25 mL空气采样液轻轻摇匀,然后均匀的分成3份,一份以含50 mL/L绵羊血的营养琼脂为培养基,用于需氧细菌培养;另一份以含体积分数5%绵羊血的营养琼脂为培养基,用于厌氧细菌培养;第3份以沙保弱为培养基,用于真菌培养,以上每个样品各重复3次。细菌在37℃恒温培养箱中培养24 h～48 h后计数,真菌在25℃恒温培养箱中培养3 d～7 d后计数。校正后计算微生物气溶胶(细菌和真菌)浓度(CFU/m3)。

1.3 DNA染色后计数

将剩余的25 mL采样液放入50 mL玻璃瓶中(该瓶先经过铬酸浸泡,后经高压灭菌处理),随即加入5 mL福尔马林,再加入7.5 mL DAPI染液(20 μ g/mL),然后置于暗室中染色10 min,最后在小于0.07大气压的条件下用硝酸纤维滤膜(经苏丹黑B染液浸泡4 h以上,使其变黑)对采样液进行抽滤。抽干后将硝酸纤维滤膜取出,置于滴有镜油的载玻片上进行计数,每一个细胞代表一个微生物气溶胶粒子(个/m3)[11]。

表1 不同畜禽舍采样时的基本情况Table 1 Backg round information on tested corral and herding sites

1.4 数据分析

采用SPSS11.5软件和Excel2007对数据进行方差分析及差异性比较。

2 结果

2.1 DAPI染色后计数的结果

利用DAPI染色的方法测得的2个鸡舍、1个猪舍和2个牛舍微生物气溶胶的浓度(中间值)分别为:166×106、166×106、136×106、0.836×106、3.73×106个/m3空气(表2)。荧光显微镜下观察,每个视野中被染色的微生物最适为30个～60个(图1),其微生物数量过多或过少都会造成计数的偏差。因此,在显微镜下观察之前必须将采样液做适当的稀释,并且抽滤时选择合适的样品量。

2.2 培养计数方法测得的畜禽舍内微生物气溶胶浓度

AGI-30采样器对2个鸡舍、1个猪舍和2个牛舍内微生物气溶胶(细菌和真菌)的浓度检测结果(中间值)分别为:38.9×105cfu/m3、27.1×105cfu/m3、26.3×105cfu/m3、2.09×105cfu/m3、5.92×105cfu/m3(表2)。对于鸡舍A和B,经AGI-30采样器收集样品后,培养计数方法测得的浓度仅占DAPI染色计数法所得浓度的2.34%和1.63%,猪舍C,牛舍D和E经培养所得微生物浓度分别占DAPI染色计数所得浓度的1.93%,2.50%和1.59%。

图1 DAPI染色后荧光显微镜下直接计数结果Fig.1 Fluorescence microscope count after DAPI staining

表2 不同畜禽舍微生物气溶胶的浓度Table 2 Concentration of microbial aerosol in corral and herding sites

3 讨论

对复杂的介质,由于其中含有使DNA粘连或者抑制酶反应的物质(如腐质酸等),使DNA克隆结果不能准确地反映真实情况[12]。使用荧光定量PCR技术可精确地测定出特定微生物的含量,但该技术对人员的操作要求较高,价格也比较昂贵,这种技术适用于对已知特定微生物的定性定量分析[13]。DAPI染色后的直接荧光镜检计数操作简单,不论是活细胞,还是死细胞、残核细胞都可以被检测出来,可得到一个客观真实的数据,是对某环境中微生物总量检测较为简捷、有效的方法。

通过本研究可知,鸡舍、猪舍和牛舍内微生物气溶胶的总浓度分别为8.0×106～3.25×108个/m3空气,1.5×107～2.28×108个/m3空气,9.0×105～5.93×107个/m3空气;而培养法测得的浓度分别为5.73×105～6.72×106cfu/m3空气,9.5×105～4.01×106cfu/m3空气,5.4×104～8.33×105cfu/m3空气。依靠培养方法所能检测出的微生物气溶胶浓度仅为实际浓度的0.04%～10.4%,与Taylor、郑天凌等使用培养计数与DAPI染色计数两种方法对不同土壤、海水中微生物浓度研究结果一致[14-15]。

在畜禽舍环境中,微生物气溶胶来源和成分非常复杂,不同微生物种类所需的培养条件和营养成分不同,因此,通过传统的培养方法所能培养出的微生物数量及种类很有限。并且,即使可培养的微生物也不一定全部培养出来。因此,传统培养方法只能在一定的条件下用于微生物的检测,难以反映真实的环境微生物状况,很大程度上限制了对实验结果的判定。

综上所述,和传统的培养法相比,DAPI染色计数法更能准确客观地定量养殖环境中微生物气溶胶的浓度,为畜禽养殖的科学管理提供更准确的依据。尽管在采样过程中未观察到人和动物的异常表现,但是长期暴露于这种环境中无疑会给人和动物的健康构成威胁,因此关注环境卫生是健康养殖的重要环节。

[1] Kodamaa M,Mcgee R I.Airborne microbial contaminants in indoor environments:Naturally ventilated and air-conditioned homes[J].Archives of Environmental Health,1986,41(5):306-311.

[2] 于玺华,车凤翔.现代空气微生物学及采检鉴技术[M].北京:军事医学科学出版社,1998:1-10,89-98,153-155.

[3] Kent A D,Triplett E W.Microbial communities and their interactions in soil and rhizosphere ecosystems[J].Annu Rev Microbiol,2002,56:211-236.

[4] Neef A,Amann R,Schleifer K H.Detection of microbial cells in aerosols using nucleic acid probes[J].Syst Appl Microbiol,1995,18:113-122.

[5] Neef A,Schafer R,Beimfohr C,et al.Fluorescence based r RNA sensor system for detection of whole cells of Saccharomonospora spp.and Thermoactinomyces spp[J].Biosens Bioelectron,2003,18:565-569.

[6] Palmgeren U,Strom G,Blomquist G,et al.Collection of airborne microorganisms on nucleopore filters,estimation and analysis-CAM NEA Method[J].Appl Bacteriol,1986,61:401-406.

[7] Horner M C,Carney K M,Bohannan B J.An ecological perspective on bacterial biodiversity[J].Proc R Soc Lond B,2004,271:113-122.

[8] Kaeberlein T,Lewis K,Epstein S S.Isolating uncultivable microorganisms in pure culture in a simulated natural environment[J].Science,2002,296:1127-1129.

[9] Kepner R L,Pratt J R.Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples:past and present[J].Microbiol,1994,58:603-615.

[10] Po rter K G,Feig Y S.The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora[J].Limnol Oceanog r,1980,25:943-948.

[11] Anderas A,Reinhard W.Detection of airborne microbes in a composting facility by cultivation based and cultivation-independent methods[M].Ann Agric Environ Med,2007,14:81-85.

[12] Ogram A,Sayler G S,Barkay T.The extraction and purification of microbial DNA from sediments[J].Microbiol Methods,1987,7:57-661.

[13] 高 斌,刘敬忠.实时荧光PCR技术的研究及其应用进展[J].诊断学:理论与实践,2005,4(6):507-5091.

[14] Taylor J P,Wilson B,Mills M S,et al.Comparison of microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques[J].Soil Biol Biochem,2002,34,387-401.

[15] 郑天凌,王 斐,徐美珠,等.台湾海峡水域的-葡萄糖苷酶的活性[J].应用与环境生物学报,2001,7(2):175-182.