小鼠-猪种间体细胞克隆试验

王利勤,郭慧利,芮 荣

(南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095)

小鼠-猪种间体细胞克隆试验

王利勤,郭慧利,芮 荣*

(南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095)

用3代～5代小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)作核供体细胞,体外成熟培养44 h～46 h、排出第1极体(PbI)的猪卵母细胞去核后,进行小鼠-猪种间核移植操作。Hoechst 33342染色检查去核效果,去核率为84.2%(27/32)。共培养68枚小鼠-猪种间核移植重构胚,其中48枚发生卵裂,卵裂率为70.6%,13枚胚胎发育至8-细胞,发育率达27.1%(13/48)。

小鼠;猪;胎儿成纤维细胞;卵母细胞;种间核移植

种间核移植是以一种动物的早期胚胎细胞或体细胞为核供体,显微注射到另一种动物的去核受体卵母细胞中,通过重编程重新获得发育能力。随着哺乳动物体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术的发展与逐步完善,SCNT已日益成为研究核质互作、转基因动物生产等的有效技术平台。目前,异种核移植研究尚处在探索阶段,这一研究对于促进基础生命科学发展,深入了解核质关系,对于珍稀和濒危野生动物保护等都有重要的理论意义和实用价值。1994年,Wakstmundzka M[1]将大鼠体细胞移植到去核的小鼠卵母细胞内,重构胚出现发育阻滞,胚胎阻滞在1-细胞或2-细胞期;而将小鼠体细胞移植到大鼠的去核卵母细胞内,则可发育至5～8-细胞期,表明核供体细胞和受体卵母细胞的来源不同,有可能对种间重构胚发育产生显著的影响。陈大元等[2]报道了大熊猫-兔种间核移植,通过将大熊猫体细胞移植给去核兔卵母细胞成功获得囊胚发育。冯秀亮等[3]也成功获得人-猪种间核移植囊胚;梅祺等[4]报道了小鼠-兔核移植研究。李光鹏等[5]将小鼠卵丘细胞移入猪的去核卵母细胞后,获得19.0%的重构胚卵裂率,但小鼠-猪种间重构胚发育终止于4-细胞期。本试验旨在建立小鼠-猪种间核移植程序,以期为进一步研究核重编程及核质互作机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 试验动物为6周龄～8周龄129×ICR杂交小鼠,129品系公鼠由河北农业大学李相运博士惠赠,ICR小鼠购自中科院上海实验动物中心,许可证号为SCXK(沪)2003-0003;按清洁级标准饲养。

1.1.2 试剂药品 孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG),天津实验动物中心生产;人绒毛膜血清促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG),宁波市激素制品厂产品;杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's phosphate buffered saline,PBS)采用国产分析纯试剂配制,TCM199为GIBCO BRL产品,其他试剂均为SIGMA产品。

1.2 方法

1.2.1 供体细胞准备 选取阴门微红的供试小鼠,分别于第1天和第3天下午4:30,腹腔注射PMSG和hCG各10 IU作超排处理;注射hCG后次日晨7:00前检查阴道栓[6],有阴道栓者记为妊娠0.5 d。选取妊娠12.5 d的孕鼠脱臼处死,无菌条件下打开腹腔,暴露子宫,分离子宫系膜,剪断子宫角,分离出整个子宫,用添加青霉素、链霉素各100单位/mL的PBS洗2次～3次,剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎;用镊子撕破胎膜,取出胎鼠置于PBS中洗2次～3次;去除鼠胚头、尾、四肢和内脏后,PBS洗3次;将鼠胚躯干剪成1 mm3小块,以组织块培养法培养在37℃、体积分数为5%CO2和饱和湿度的CO2培养箱内,获得原代小鼠胚胎成纤维细胞记为MEF(0)。隔天换液,每日观察细胞生长情况。MEF(0)生长达到80%汇合时进行传代培养,先去除培养液,用无血清PBS洗1次～3次,再加入2.5 g/L胰酶1 mL,轻轻摇晃,消化2 min后细胞变园,部分浮起后即以等体积培养液终止消化;回收细胞离心洗涤后,按1∶2比例进行传代[7]。按此法传代培养3代～5代时,取适量细胞用作核移植供体细胞。

1.2.2 受体卵母细胞体外成熟与去核 采用猪体外成熟(in vitromaturation,IVM)卵母细胞作核移植受体卵母细胞,IVM方法可参照文献[8]。简言之,采集猪屠宰卵巢,用抽吸法采集直径2 mm～5 mm卵泡卵母细胞,实体显微镜下捡取胞质均匀、包被3层及其以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complex,COC)。COC先用TL-Hepes(台氏缓冲液)洗2次,再用 TCM199洗2次作成熟培养。成熟培养液为TCM 199培养液添加 100 mL/L NCS、36 mg/L 丙酮酸钠、1 mL/L 乳酸钠、100 mL/L猪卵泡液(porcine follicular fluid,pFF;自 制)、10 IU/mL PMSG 、10 IU/mL hCG 、69 μ g/mL L-半胱氨酸和 1 μ g/mL 17β-雌二醇(17β-E2)、70 mg/L青霉素和 50 mg/L链霉素。采用100 μ L微滴法作成熟培养,上盖石蜡油,用前在CO2培养箱预平衡。

按照本实验室剧世强[8]报道的方法进行卵母细胞成熟培养和去核,出现第一极体(first polar body,pbI)者判为卵母细胞成熟。将成熟卵母细胞转入1 g/L透明质酸酶中,37℃孵育3 min,微吸管轻轻吹打去除卵丘细胞,捡取裸卵到T L-Hepes液中洗3次,将卵丘细胞去除干净。去核时,成熟卵母细胞与事先准备的MEF同时移入操作滴(TCM199-Hepes添加7.5 μ g/mL细胞松弛素 B)中,于38.5℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度的CO2培养箱中平衡15 min后进行去核操作。固定针固定卵母细胞,使pbI置于1点钟位置,去核针从3点钟位置刺过透明带,吸去pbI及其附近约20%左右的胞质,等待注射。随机选择部分去核卵母细胞 ,于 5 μ g/mL Hoechst 33342 TCM199 中孵 育15 min,在荧光显微镜下检查去核效果。

1.2.3 异种重构胚构建与电激活/电融合 用注核针吸取1个大小适中、形态较好、表面光滑的MEF,从去核切口注入卵周隙,轻压透明带,使供核细胞与受体卵母细胞质膜彼此接触,便于融合。注射后将重构胚移入4 g/L BSA NCSU23培养液中恢复培养1.5 h～2 h后进行电融合与电激活。所用参数为1.5 kV/cm、80 μ s和 1 DC 的优化参数组合[8]。

1.2.4 种间重构胚的体外培养 所获核移植重构胚用4 g/L BSA NCSU23培养液洗3次后,移入经预先平衡的500 μ L 4 g/L BSA NCSU23培养液中培养,培养条件为38.5℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度;每天检查并记录重构胚卵裂与发育情况。

2 结果

以小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)为核供体细胞(图 1a),排出pbI的猪成熟卵母细胞为核移植受体细胞(图1b),核移植所用去核卵母细胞经Hoechst 33342染色检查(图1c),去核率为84.2%(27/32)。小鼠-猪种间核移植重构胚发育情况列如表1,共培养68枚种间核移植重构胚,其中48枚发生卵裂,卵裂率为70.6%,13枚胚胎发育至8-细胞(图1d)。

图1 小鼠-猪种间克隆胚胎的获得Fig.1 Preparation of mouse-pig interspecies cloned embryos

表1 小鼠-猪种间核移植重构胚的体外发育Table 1 In vitro development of mouse-po rcine interspecies reconstructed embryos

3 讨论

迄今为止,种间核移植尚未获得妊娠足月的哺乳动物后代。影响种间核移植的因素很多,除影响核移植的一般因素(如核供体细胞传代次数、受体卵母细胞的成熟培养、显微操作等)外[8],异种核移植可能需要更多考虑核质关系及其相互作用。

来源不同种属动物的细胞染色体数目常不相同,被报道用于种间核移植的动物染色体数目(2n)分别为猪38、小鼠 40、大熊猫 42、大鼠42、兔 44、牛60、犬78和人46。陈大元等在大熊猫-兔种间核移植时发现,源自骨骼肌、子宫上皮和乳腺组织的3种核供体细胞,移植后的融合率相当,均在50%～55%之间;并证明卵胞质使体细胞核去分化不具有种特异性,哺乳动物异种重构胚早期发育的异种细胞核与细胞质之间是相容的[2]。梅祺等[4]报道的鼠-兔核质杂交总卵裂率为43.1%。不同种属间进行异种核移植时,可能由于亲缘差异,导致卵裂结果的差别;来自同种动物的不同核供体细胞也会出现重构胚发育的不同差别。由大熊猫骨骼肌、子宫上皮和乳腺组织培养的细胞,异种核移植后发现乳腺来源的细胞所获囊胚率最高,子宫上皮细胞次之,而骨骼肌细胞效果最差,认为可能与细胞的分化程度有关[2]。在李光鹏等的试验中,以小鼠8-细胞卵裂球作核供体时,3.2%(2/62)可发育到8-细胞期;而用小鼠卵丘细胞移入去核猪卵母细胞后,则有19.0%的重构胚发生卵裂,但停滞于4-细胞期[5]。本试验选用MEF作核供体,鼠猪异种核移植胚卵裂率为70.6%,8-细胞胚发育率达27.1%,明显高于李光鹏等的试验结果;这与试验所用方法不同有关,为进一步进行相关研究奠定了良好基础。

一般情况下,细胞经6次～10次传代后,其增殖能力会逐渐衰退,细胞特性也会有所改变。同其他细胞一样,MEF特性也非一直恒定的,传代3次～5次就可得到较好的纯化;在大约80%汇合时进行传代有助于防止细胞老化;采用处于快速增殖阶段的3代～5代MEF作为核供体细胞,有利于重构胚胎发育[9]。在体细胞核移植过程中,核供体细胞核携带着自身组织特异性表观遗传特征,作为受体的卵母细胞对供体细胞核重编程作用不完全,也是导致体细胞核移植效率低下的主要原因。供体细胞与受体胞质细胞周期的协调性对核移植胚胎的发育具有明显影响。早期胚胎发育受贮存在卵母细胞内mRNA和蛋白质的调控(母型调控),随着发育的继续,它就开始依赖胚胎自身的合子型基因组的调控(合子型调控)。因此,重构胚的前期发育主要是受体卵母细胞的胞质占主导作用,而后期则是以核供体细胞的核物质占主导。当经体细胞移植到去核的卵母细胞内时,细胞核发生去分化,关闭所有转录基因,进行重编程[10]。异种胞质能够对供体细胞核进行完善的重编程,启动体细胞核基因组有序的表达,从而调控异种克隆胚胎的全程发育,这体现了异种核质之间的相容性,但是到相斥性占主导时,又会导致重构胚发育的阻滞。

种间核移植常表现出高流产率及异常表型,是研究核重编程分子机制、异种细胞核质互作关系和早期胚胎发育的理想模型。种间核移植研究也是濒危野生动物保护的有力工具,在农业、医学等领域都具有广阔的应用前景。

[1]Waksmundzka M.Development of rat×mouse hybrid embryos produced by microsurgery[J].J Exp Zool,1994,269(6):551-559.

[2]陈大元,孙青原,刘翼珑,等.大熊猫供核体细胞在兔卵母胞质中可去分化而支持早期重构胚发育[J].中国科学(C辑),1999,29(3):324-330.

[3]冯秀亮.人-猪异种细胞核移植研究[D].陕西杨陵:西北农林科技大学,2003:79-83.

[4]梅 祺.鼠兔核质杂交胚胎早期发育的研究[J].实验生物学报,1993,26:389-393.

[5]李光鹏,兰国成,刘 莹,等.鼠猪异种细胞核移植[J].动物学研究,2000,21(5):416-418.

[6]周结学,刘 东,郑克立,等.鼠胚成纤维细胞的培养条件及滋养层制备[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,34:6607-6611.

[7]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001:516-517.

[8]剧世强,芮 荣,卢 庆,等.猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验[J].中国农业科学,2009,42(4):1386-1393.

[9]董 韬,纪 红,秦逸人,等.昆明小鼠胚胎成纤维细胞分离培养及应用[J].解剖科学进展,2008,14(1):19-23.

[10]Ono Y,Shimozawa N,Ito M,et al.Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer[J].Biol Reprod,2001,64(1):44-50.

Experiment on Somatic Cell Clone in Mouse-pig Interspecies

WANG Li-qin,GUO Hui-li,RUI Rong

(College of Veterinary Medicine,Nanj ing Agricultural University,Nanjing,J iangsu,210095,China)

Mouse embryonic fibroblasts at 3-5 passages were used as nuclear donor cells and porcine oocytes maturatedin vitrofor 44-46 h with pbI were used as recipients after enucleation.Mouse-pig interspecies nuclear transfer was conducted in the present experiment.The enucleation was examined by Hoechst 33342 staining,resulting in an enucleation rate of 84.2%(27/32).A total of 68 reconstructed embryos derived from mouse-pig interspecies nuclear transfer were culturedin vitroand 48 embryos among which cleavaged,resulting in 70.6%of cleavage rate.13 reconstructed embryos developed into 8-cell stage and the developmental rate reached 27.1%(13/48).

mouse;pig;embryonic fibroblast;oocyte;interspecies nuclear transfer

S814.8

A

1007-5038(2010)01-0027-04

2009-08-29

国家高技术研究与发展计划(2008AA101003);农业部“十一五”科技支撑计划(2008BADB2B11)

王利勤(1985-),女,四川乐山人,硕士研究生,主要从事动物生殖生物学研究。*通讯作者